Одноместный измерительной ячейки из высвобождение дофамина с одновременным напряжения зажим и амперометрии

Целью этой процедуры является измерение обратного транспорта дофамина в нейроне, который зажат напряжением, с использованием одновременного патч-зажима и пирометрии для измерения DAT-опосредованного высвобождения D. Это достигается путем предварительного тестирования целостности пирометрического электрода с допамином. Второй шаг заключается в размещении пирометрического электрода рядом с клеткой и достижении целого клеточного участка нейрона с помощью патч-пипетки.

Затем напряжение клетки контролируется с помощью патч-пипетки, и одновременно с помощью пирометрического электрода регистрируется опосредованный DAT дофамин. Последним шагом является добавление блокатора DAT и повторная запись токов всей клетки и пирометрии, чтобы позволить вычесть ток, специфически опосредованный транспортером дофамина. Значение этого метода заключается в возможности измерения обратного транспорта дофамина через транспортер дофамина при одновременном контроле напряжения дофаминергического нейрона.

Для одновременной записи патч-зажима и барометрии требуется инвертированный микроскоп с отличной оптикой DIC и линзой с большим рабочим расстоянием для генерации источника постоянного света для системы. При низком электрическом шуме подключите микроскоп маяк к автомобильному аккумулятору. Гидравлические микроманипуляторы используются потому, что они не вносят заметного вклада в уровень шума в нашей конфигурации.

Манипулятор для правой руки используется для зажима напряжения, записи всей ячейки, а манипулятор для левой руки — для пирометрии. Чтобы подготовить электрод к оптовой записи, вытяните кварцевую пипетку с помощью съемника P 2000. Как правило, мы используем пипетку с сопротивлением от трех до четырех мегаом.

Далее заполните электрод раствором пипетки, содержащим один миллимоляр дофамин. Затем закрепите его на держателе пипетки на правом манипуляторе. Обязательно оберните контейнер, в котором находится дофаминсодержащий раствор пипетки, алюминиевой фольгой и держите его на льду, когда он не используется.

Поскольку дофамин окисляется, хранение раствора на льду и в защищенном от света снижает скорость окисления. Проденьте серебряный провод в держатель электрода, затем наденьте параметрический адаптер am на держатель электрода. Затем заполните тричный электрод ртутью в количестве, достаточном для контакта с серебряной проволокой.

Когда электрод установлен на адаптере, обязательно осмотрите низкошумный углеродный электрод и параметрический электрод pro CFE под микроскопом, чтобы убедиться, что наконечник чистый и неповрежденный. Обязательно придерживайте дальний конец углеродного волокна для того, чтобы защитить кончик углеродного волокна от повреждений. Затем установите профессиональный электрод CFE Tric.

Впоследствии установите собранный электрод на левый гидроманипулятор для проверки целостности тричного электрода. Опустите его в чашку Петри со стеклянным дном, содержащую наружный раствор. Запишите исходный ток при отсутствии дофамина.

Затем добавьте в блюдо 10 микролитров одного миллимолярного раствора дофамина. Хороший метрический электрод должен регистрировать увеличение окислительного тока. Обязательно проверьте целостность метрического электрода эмпера до и после экспериментов.

В ходе этой процедуры извлекаются из инкубатора дофаминовые нейроны или клетки, сконструированные для экспрессии транспортера дофамина, помещенные в чашку Петри со стеклянным дном. Аккуратно промойте клетки или дофаминовые нейроны трижды теплым наружным раствором. Чтобы визуализировать клетки и провести эксперимент, установите чашку Петри со стеклянным дном на предметный столик микроскопа и найдите правильную фокусную точку для четкой визуализации клеток.

Далее надавите положительным давлением на накладной электрод. С помощью шприца объемом в один миллилитр осторожно опустите оба электрода вниз в раствор и приблизьте клетку с помощью микроманипуляторов. Затем расположите метрический электрод эмпера с левой стороны элемента, а накладной электрод — справа.

Когда патч-электрод соприкасается с клеткой. Нанесите легкое отсасывание ртом или шприцем, чтобы сформировать гига-уплотнение на клетке. После этого разорвите уплотнение с помощью всасывания, чтобы добиться конфигурации всей клетки, и дайте пять-восемь минут для диализа внутреннего раствора, содержащего допамин, в клетку.

Затем зарегистрируйте опосредованные DAT токи, повышая напряжение клеточной мембраны в диапазоне от минус 60 до плюс 100 милливольт от удерживающего потенциала минус 40 милливольт через пипетку. Для определения специфического DAT опосредованного дофамина flx записывают эмперные метрические токи в отсутствие и в присутствии антагониста DAT. Специфический ток, опосредованный DAT, затем определяют путем вычитания следов, зарегистрированных в присутствии антагониста DAT, из следов эмпера, записанных без антагониста.

Отклонение токов трика вверх соответствует показанному здесь потоку дофамина наружу. DAT опосредует токи, регистрируемые путем повышения напряжения мембраны на 20 милливольт в диапазоне от минус 60 до плюс 100 милливольт от удерживающего потенциала минус четыре С милливольт с помощью пипетки, содержащей два миллимоляра дофамина в режиме коммутации всей клетки. Здесь представлен метрический ток Эмпера, полученный одновременно с током всей ячейки.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как измерить обратный транспорт дофамина через транспортер дофамина в напряженном нейроне. Не забывайте проверять целостность параметрического электрода до и после экспериментов и не забывайте вычитать следы, записанные в присутствии этого антагониста, из следов, записанных без антагониста.