Подготовка парасагиттальных фрагментов для исследования спинного-вентральной организации грызунов медиальной энторинальной коры

Мы описываем процедуры подготовки и электрофизиологические записи с срезах мозга, которые поддерживают спинно-вентральной оси медиальное энторинальной коры (MEC). Поскольку нейронная кодирования место следующим спинно-вентрально организации в MEC, эти процедуры облегчить исследование клеточных механизмов, важных для навигации и память.

Общей целью данного эксперимента является изучение топографической организации синаптических и интегративных свойств нейронов в медиальной входной коре головного мозга. Это достигается за счет приготовления срезов медиального входа в RH коры, ориентированной в дорсальной вентральной плоскости. В качестве второго шага делаются записи патч-клэмпа нейронов коры головного мозга менто для исследования их синаптических и интегративных свойств.

Далее определяется расположение регистрируемого нейрона для оценки дорсальной вентральной организации электрофизиологических измеряемых свойств. Получены результаты, которые показывают топографическую организацию внутренних свойств звездчатых клеток во втором слое на основе измерений их входного сопротивления, мембранной временной постоянной и порога потенциала действия, Продемонстрируя эту процедуру будет Хью Пастель, аспирант из своей лаборатории. Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как горизонтально ориентированные срезы мозга, заключается в том, что положение регистрируемого нейрона вдоль дорсальной вентральной оси внутренней коры может быть точно зарегистрировано.

Чтобы начать эту процедуру, извлеките мозг из мыши и сразу же поместите его в холодную резку. Искусственная спинномозговая жидкость пузырится карбогеном. Через три минуты аккуратно извлеките мозг из разреза А СМЖ с помощью шпателя.

Аккуратно положите его в вертикальном положении на фильтровальную бумагу, смоченную для резки спинномозговой жидкости. Затем с помощью бритвы или скальпеля удалите как можно больше мозжечка, не затрагивая медиальную энтеральную кору, которая расположена на сердечном краю головного мозга. Удаляют ростральную часть головного мозга путем разрезания в корональной плоскости.

Далее hemis sec, мозг в вертикальной плоскости средней линии. После этого верните полушария в пузырчатую резку ликвора на полторы минуты перед монтажом. Убедитесь, что режущая кромка лезвия вибрато расположена под углом 20 градусов от горизонтали На монтажной поверхности сделайте неглубокую полосу суперклея параллельно лезвию вибрато, примерно шириной полусферы и достаточной длиной, чтобы вместить две полусферы встык.

Затем перенесите каждую полусферу с места резки спинномозговой жидкости на монтажную поверхность, расположив полусферу так, чтобы ее медиальная поверхность опиралась на шпатель, а ее тыльная часть была обращена к лезвию вибрационного тона. Аккуратно наденьте полусферу на полоску суперклея и убедитесь, что медиальная поверхность каждой полусферы параллельна основе вибрато. После этого сразу же погрузите полусферы в холодную резку.

Спинномозговая жидкость. Поддерживайте температуру и насыщенность автомобиля на протяжении всей процедуры нарезки. С помощью вибрама удаляйте кору головного мозга с обоих полушарий в сагиттальной плоскости до тех пор, пока наиболее латеральная часть медиальной энтеральной коры в каждом полушарии не будет идентифицирована на расстоянии не менее 600 микрометров от боковой поверхности.

Латеральная протяженность медиальной энтеральной коры определяется по отсутствию толстой белой полосы вокруг вентрального изгиба гиппокампа. Невыпуклая форма его ростральной границы и угловой дорсальный угол колечка разрезают парасагиттальные срезы размером 400 микрон от обоих полушарий до тех пор, пока не будет достигнута медиальная протяженность медиальной энтеральной коры. После каждого разреза немедленно помещайте ломтики в насыщенный карбогеном стандартный СМЖ А, поддерживаемый на водяной бане при температуре 35 градусов Цельсия, и инкубируйте их примерно 15 минут.

Через 15 минут снимите держатель для ломтиков с водяной бани и продолжайте барботировать карбогеном при комнатной температуре не менее 45 минут. Переложите кусочек в записывающую камеру, которая непрерывно пузырится карбогеном, насыщенным стандартным A-C-S-F-A 35 градусами Цельсия. Затем определите приблизительную область записи в медиальной входной коре головного мозга.

Затем переключитесь на объектив с большим увеличением. Определите жизнеспособные клетки в этой области. На этом этапе можно проводить эксперименты с использованием обычного клеточного зажима для записи мембранного потенциала или мембранного тока от идентифицированных нейронов.

Идентичность нейронов может быть проверена по электрофизиологическим свойствам регистрируемого нейрона и путем включения флуоресцентных меток во внутриклеточный раствор. После проведения эксперимента по определению положения регистрируемого нейрона вдоль дорсальной вентральной оси переключитесь на объектив с малым увеличением. Отметьте интересующее местоположение, включив записывающий электрод в изображение или опустив диафрагму диафрагмы диафрагмы с диафрагмой поля.

Чтобы оставить яркий круг вокруг интересующего места на дубликате изображения, медиальной и относительной коры и окружающих областей среза для точного определения места записи на изображении, дубликат может быть затем наложен на исходное изображение места записи и его окружения. Для охвата области от места вентральной записи до дорсальной границы медиальной интеральной коры может потребоваться до трех отдельных изображений с малым увеличением. Затем эти изображения могут быть сшиты вместе с помощью программного обеспечения для обработки изображений.

Дорсальная граница медиальной энтеральной коры обеспечивает удобный ориентир для измерения дорсального вентрального положения, но вентральная граница медиальной энтеральной коры не так хорошо определена. Здесь. Парасагиттальные срезы DIC и NIAL показывают круговой гиппокамп и отсутствие пара-оркулярного выступа в первом слое латеральной энтеральной коры соответственно. Это изображения типичных срезов, которые содержат медиальную энтеральную кору.

Область параса отчетливо видна по окрашиванию ракетами. На соответствующих изображениях дорсальная граница медиальной энтеральной коры, обозначенная черной стрелкой, вентральна по отношению к группе пара-ортикулярных клеток, которая выступает далеко в первый слой, как указано красной стрелкой. Вот пример составного изображения сагиттального среза с четырехкратным увеличением.

Положения дорсальной и вентральной клеток обозначены синим и зеленым закрашенными кругами соответственно. Черная стрелка отмечает предполагаемую дорсальную границу медиальной внутренней коры и простирается в глубокие слои белой пунктирной линией. Сплошная белая линия является ориентиром, показывающим контурную траекторию, вдоль которой показано пиксельное измерение расстояния от дорсальной границы медиальной интеральной коры до вентрально расположенных клеточных записей от отмеченных дорсальных и вентральных звездчатых клеток.

Эти записи помогают установить идентичность клеток и иллюстрируют, как электрические свойства медиальной среды проникают в кору головного мозга. Звездчатые клетки второго слоя различаются в дорсальном и вентральном положениях При попытке выполнить эту процедуру. Важно помнить о необходимости быть исключительно осторожным во время подготовки слайсов, так как высококачественные срезы необходимы для продуктивной электрофизиологической записи.