Мониторинг восстановительной и окислительной Half-Реакции Флавин-зависимой монооксигеназной использованием Остановлено-Flow спектрофотометрии

В этой процедуре используется прибор с остановленным потоком для обнаружения различных спектральных форм SID A и измерения скоростей. Реакцию, катализируемую SID A, можно разделить на восстановительную и окислительную полуреакции FAD. Окисленный флавин связывается с N-A-D-P-H и вступает в реакцию с образованием восстановленного флавина и NADP плюс реакцию молекулярного кислорода, а связывание орнитина приводит к образованию C 4.

Гидроксифлавин после гидроксилирования орнитина, гидроксифлавин дегидратируется с образованием окисленного фермента. NA DP plus остается связанным на протяжении всего каталитического цикла и является последним субстратом, который высвобождается. Прибор с остановленным потоком способствует быстрому смешиванию небольших объемов реагентов и пластинок.

Спектральные изменения во времени Спектрофотометр потерь материала позволяет измерить скорость образования и реакции, катализируемой ферментами, в частности, переходных промежуточных продуктов. Два сотрудника моей лаборатории, Рита Робинсон и Энвиро Ромеро, продемонстрируют эти эксперименты, используя набор А в монооксигеназе вкуса в качестве модельной системы. Налейте 250 миллилитров 100 миллимолярного буфера фосфата калия в 500-миллилитровую колбу Бюхнера, содержащую мешалку.

Запечатайте колбу резиновой пробкой, затем поместите ее на пластину для перемешивания и подсоедините короткую трубку колбы к боковой линии. Дегазируйте буфер под вакуумом в течение часа при комнатной температуре с последующим промыванием аргонной. Повторите пять раз.

Наконец, промойте колбу с помощью Аргонны в течение 10 секунд. Отсоедините колбу от вакуумного коллектора и поместите ее внутрь бардачка. Продолжайте энергично помешивать с открытой колбой.

Наполните резервуарные шприцы 18,13 единицами на миллилитр глюкозооксидазы и 100 миллимолярными растворами глюкозы. Теперь установите приводные клапаны в положение нагрузки. Наполните приводные шприцы.

Затем поверните клапан F в положение привода. Используя программное обеспечение для управления данными pro, нажмите «Опорожнить стопорный шприц», затем протолкните буфер от приводного шприца F через проточный контур, вручную подняв соответствующий приводной цилиндр. Продолжайте с помощью трех других приводных шприцев, уравновешивайте в течение часа.

Теперь заправьте резервуар шприцев и повторите промывку остановленной системы потока. Для приготовления насыщенного кислородом буфера. Пузырчате раствор со 100% кислородом в течение одного часа с перемешиванием.

Затем извлеките короткую иглу из флакона и подождите 10 секунд. Снимите длинную иглу и поместите закрытый флакон в бардачок. Для решения N-A-D-P-H.

Поместите в бардачок пробирку эйнора объемом 1,5 миллилитра, содержащую один миллиграмм N-A-D-P-H. Растворите в 300 микролитрах анаэробного, 100 миллимолярного калийфосфатного буфера. рН 7,5.

Удалите 30 микролитров, чтобы определить концентрацию N-A-D-P-H. Теперь, чтобы удалить кислород из запаса ферментов, перелейте раствор в 25-миллилитровый флакон, содержащий крышку мешалки с пшеничной и пробкой и алюминиевым уплотнением. Выложите на лед.

Подключите к линии Schlink, затем вакуумируйте в течение 20 минут, после чего промывайте аргонной. Наконец, промойте флакон с помощью Argonne в течение 10 секунд и отсоедините его от вакуумного коллектора. Поместите пузырек на лед внутрь бардачка.

В окне панели управления программного обеспечения для управления данными pro. Выбор матрицы фотодиодов, внешнего триггера и логарифмической шкалы. Также запустите профессиональное программное обеспечение для просмотра данных и определите каталог для хранения файлов данных.

Теперь замените раствор в резервуарных шприцах С и F на анаэробный 100 миллимолярный буфер фосфата калия рН 7,5. Поверните клапаны C и F в положение привода. Нажмите «Опорожнить стопорный шприц» в программном обеспечении для контроля данных pro

Затем протолкните буфер от обоих приводных шприцев через проточный контур, вручную подняв соответствующий приводной цилиндр. Повторите промывку шприцами-резервуарами С и F еще три раза. Чтобы обеспечить полное удаление глюкозооксидазы из проточного контура, перейдите к нажатию на базовую линию в программном обеспечении для контроля данных pro

Замените раствор резервуарного шприца F на раствор фермента. Поверните клапан F в положение привода. Нажмите «Опорожнить стопорный шприц» в программном обеспечении для контроля данных pro

Протолкните раствор фермента из приводного шприца F через проточный контур, вручную подняв соответствующий приводной цилиндр. Вернитесь к профессиональному программному обеспечению для управления данными, чтобы установить время сбора данных на 60 секунд. Убедитесь, что оба приводных шприца заполнены соответствующими растворами и что поршни привода находятся в контакте с приводным шприцем. Поршни.

Поверните оба клапана в положение привода и нажмите «Получить» в программном обеспечении для управления данными pro, чтобы выполнить привод. Получение спектральных данных окисленной формы фермента в трех экземплярах с использованием значения A 4 52 нанометра, полученного от приводов. Перед смешиванием определите концентрацию фермента и приготовьте четыре миллилитра раствора N-A-D-P-H.

В 1,5 раза больше концентрированного наполните резервуар шприца С раствором N-A-D-P-H и опорожните и наполните стопорный шприц три раза, как показано ранее. Теперь получаем спектры при восстановлении содержимого фермента промывки из проточного контура с помощью анаэробного 100 миллимолярного буфера фосфата калия pH 7,5. Теперь нажмите на базовую линию в программном обеспечении для контроля данных pro

Затем смешайте 200 микролитров стокового раствора фермента со 1000 микролитрами анаэробного, 100 миллимолярного буфера фосфата калия. pH 7,5. Замените раствор резервуарного шприца А на раствор фермента.

Поверните клапан A в положение привода в программном обеспечении для контроля данных pro. Опустошите стопорный шприц. Протолкните раствор фермента из приводного шприца А через проточный контур, вручную подняв соответствующий приводной цилиндр.

Установите время задержки на 0,5 секунды и время сбора данных на 60 секунд. Убедитесь, что все приводные шприцы заполнены соответствующими растворами и что поршни приводных шприцев находятся в контакте с поршнями приводных шприцев. Затем поверните все приводные клапаны в положение привода и нажмите «Получить» в программном обеспечении для управления данными pro

Получить спектральные данные об окисленной форме фермента в трех экземплярах. Далее замените раствор резервуарного шприца В на раствор N-A-D-P-H. В 1,5 раза концентрированнее, чем ферментный раствор в шприце А. Поверните клапан В в положение привода и опорожните и снова наполните стопорный шприц три раза, как показано ранее в окне панели управления.

Установите время задержки на 0,5 секунды. При захвате через 20 секунд замените раствор резервуара шприца морского на насыщенный кислородом буфер. Поверните клапан C в положение привода.

Промывайте три раза в профессиональном программном обеспечении для контроля данных. Установите время задержки на 15 секунд и время сбора данных на 900 секунд. Продолжайте получать спектры во время повторного окисления полностью восстановленного фермента в приборе с остановленным потоком.

Анаэробное восстановление SID A с N-A-D-P-H можно контролировать путем измерения изменений окислительно-восстановительного состояния флавина с использованием абсорбента при 452 здесь. Спектральные изменения регистрируются с течением времени от окисленного SID A до последнего спектра полностью восстановленного SID A. Скорость этого ферментативного шага может быть определена путем подгонки данных к соответствующему уравнению. Скорость окисления и промежуточные продукты реакции также могут быть определены с помощью режима двойного смешивания остановленного потока в этой реакции с помощью AF Sid A. Промежуточный продукт C four A Hydroxi flavin четко обнаруживается с помощью лямбда max три 80 нанометров, а окисленный фермент имеет лямбда max 450 нанометров.

После освоения этой техники ее можно выполнить за четыре-шесть часов, если она выполнена правильно. Не забывайте следить за тем, чтобы растворы были анаэробными. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как исследовать как относительный, так и язвенный ион независимого моно FLA в дальнейшем эксперименте, таком как быстрое химическое вещество.

Квентин может помочь пролить свет на печальную природу промежуточных звеньев.