Мониторинг восстановительной и окислительной Half-Реакции Флавин-зависимой монооксигеназной использованием Остановлено-Flow спектрофотометрии
18 марта 2012 г.
Мы описываем использование остановил поток инструментом для исследования и восстановительного и окислительного половины реакций Aspergillus фумигатус Сидерофора (SIDA), флавин-зависимой монооксигеназной. Затем мы показываем, спектров, соответствующих видов реакции SIDA и вычислить константы скорости их образования.
В данной процедуре используется прибор для остановленного потока с целью обнаружения различных спектральных форм SID A и измерения скоростей реакций. Реакция, катализируемая SID A, может быть разделена на восстановительную и окислительную полуреакции FAD. Окисленный флавин связывается с N-A-D-P-H и вступает в реакцию с образованием восстановленного флавина и NADP; последующая реакция с молекулярным кислородом и связывание орнитина приводят к образованию C four.
После гидроксилирования орнитина образуется гидроксифлавин, который затем подвергается дегидратации с образованием окисленной формы фермента. NADP⁺ остается связанным на протяжении всего каталитического цикла и высвобождается последним из всех субстратов. Прибор для остановленного потока обеспечивает быстрое смешивание малых объемов реагентов и регистрацию данных.
Изменение спектра во времени с помощью спектрофотометра позволяет измерить скорость образования и распада промежуточных продуктов ферментативной реакции, особенно короткоживущих интермедиатов. Двое сотрудников моей лаборатории, Рита Робинсон и Энвиро Ромеро, продемонстрируют эти эксперименты, используя набор A с флавомонооксигеназой в качестве модельной системы. Налейте 250 milliliters 100 millimolar калий-фосфатного буфера в колбу Бухнера объемом 500 milliliters, содержащую магнитный перемешиватель.
Закройте колбу резиновой пробкой, затем поместите ее на магнитную мешалку и подсоедините короткий отвод колбы к вакуумной линии Шленка. Удалите растворенный газ из буфера под вакуумом в течение одного часа при комнатной температуре с перемешиванием, после чего продуйте систему аргоном. Повторите процедуру пять раз.
В завершение продуйте колбу аргоном в течение 10 секунд. Отсоедините колбу от вакуумного манифольда и поместите ее в перчаточный бокс. Продолжайте интенсивное перемешивание при открытой колбе.
Заполните шприцы-резервуары растворами глюкозооксидазы в концентрации 18,13 ед/мл и 100 мМ глюкозы. Установите приводные клапаны в положение загрузки. Заполните приводные шприцы.
Затем переведите клапан F в положение подачи. Используя программное обеспечение для управления данными Pro, нажмите «очистить стоп-шприц», затем вытесните буфер из приводного шприца F через контур потока, вручную поднимая соответствующий приводной шток. Повторите процедуру для остальных трех приводных шприцев; установите равновесие системы в течение одного часа.
Теперь снова заполните шприцы-резервуары и повторите промывку системы с остановленным потоком. Для приготовления насыщенного кислородом буфера продувайте раствор 100% кислородом в течение одного часа при перемешивании.
Затем извлеките короткую иглу из флакона и подождите 10 секунд. После этого извлеките длинную иглу и поместите закрытый флакон в перчаточный бокс. Повторите процедуру для раствора N-A-D-P-H.
Поместите в перчаточный бокс микроцентрифужную пробирку объемом 1.5 мл, содержащую 1 мг NADPH. Растворите его в 300 µL анаэробного 100 мM калий-фосфатного буфера с pH 7.5.
Отберите 30 µL для определения концентрации N-A-D-P-H. Для удаления кислорода из запаса фермента перенесите раствор в виалу объемом 25 мл, снабженную крышкой с магнитным перемешивателем, пробкой и алюминиевым уплотнителем. Поместите на лед.
Подключите к линии Шленка, затем удалите растворенные газы с помощью вакуума в течение 20 минут, после чего промойте систему аргоном. В завершение продуйте флакон аргоном в течение 10 секунд и отсоедините его от вакуумного манифольда. Поместите флакон на лед внутри перчаточного бокса.
В окне панели управления программного обеспечения ProData выберите фотодиодный массив, внешний триггер и логарифмическую шкалу. Также запустите программу ProData Viewer и укажите директорию для хранения файлов данных.
Теперь замените раствор в резервуарных шприцах C и F на анаэробный 100 millimolar калий-фосфатный буфер pH 7.5. Поверните клапаны C и F в рабочее положение. В программном обеспечении управления данными Pro нажмите кнопку опорожнения стоп-шприца.
Затем вытолкните буфер из обоих шприцев подачи через контур потока, вручную поднимая соответствующий приводной поршень. Повторите промывку шприцами из резервуаров C и F еще три раза. Чтобы обеспечить полное удаление глюкозооксидазы из контура потока, нажмите кнопку baseline в программном обеспечении pro data control.
Замените раствор в резервуарном шприце F раствором фермента. Поверните клапан F в положение подачи. В программном обеспечении Pro Data Control нажмите кнопку опорожнения стоп-шприца.
Протолкните раствор фермента из шприца-дозатора F через контур потока, вручную поднимая соответствующий приводной толкатель. Вернитесь в программное обеспечение для управления данными Pro и установите время сбора данных на 60 секунд. Убедитесь, что оба шприца-дозатора заполнены соответствующими растворами, а приводные толкатели контактируют с поршнями шприцев-дозаторов.
Переведите оба клапана в положение «drive» и нажмите кнопку «acquire» в программном обеспечении Pro Data Control для запуска процесса. Соберите спектральные данные окисленной формы фермента в трех повторностях, используя значение A 452 нм, полученное в ходе измерений. Определите концентрацию фермента перед смешиванием и приготовьте четыре миллилитра раствора N-A-D-P-H.
Заполните шприц-резервуар C раствором N-A-D-P-H, который в 1,5 раза более концентрирован, затем трижды опорожните и снова заполните стопорный шприц, как было показано ранее. Теперь снимите спектры в процессе восстановления фермента, промывая содержимое проточного контура анаэробным 100 millimolar калий-фосфатным буфером pH 7.5. После этого нажмите кнопку «baseline» в программном обеспечении pro data control.
Затем смешайте 200 µL стокового раствора фермента с 1000 µL анаэробного 100 мМ калий-фосфатного буфера (pH 7,5). Замените раствор в резервуарном шприце А на раствор фермента.
Переведите клапан A в положение «drive» в программном обеспечении Pro Data Control. Нажмите кнопку «stop syringe empty». Протолкните раствор фермента из шприца подачи A через контур потока, вручную поднимая соответствующий толкатель шприца.
Установите время задержки на 0,5 seconds, а время сбора данных — на 60 seconds. Убедитесь, что все шприцы привода заполнены соответствующими растворами, а поршни приводов соприкасаются с поршнями шприцев. Затем переведите все клапаны привода в рабочее положение и нажмите кнопку acquire в программном обеспечении pro data control.
Получите спектральные данные окисленной формы фермента в трех повторностях. Затем замените раствор в резервном шприце B раствором N-A-D-P-H, концентрация которого в 1,5 раза выше, чем концентрация раствора фермента в шприце A. Переведите клапан B в рабочее положение, затем трижды опорожните и снова наполните стопорный шприц, как показано ранее в окне панели управления.
Установите время задержки на 0,5 seconds. При достижении 20 seconds сбора данных замените раствор в шприце-резервуаре на оксигенированный буфер. Переведите клапан C в рабочее положение.
Выполните промывку три раза в программном обеспечении pro data control. Установите время задержки 15 секунд и время сбора данных 900 секунд. Продолжайте регистрировать спектры во время повторного окисления полностью восстановленного фермента в приборе с остановленным потоком.
Анаэробное восстановление SID A с помощью N-A-D-P-H можно отслеживать, измеряя изменения окислительно-восстановительного состояния флавина с помощью абсорбции при 452 нм. Спектральные изменения регистрируются во времени — от окисленной формы SID A до последнего спектра полностью восстановленного SID A. Скорость этого ферментативного этапа может быть определена путем аппроксимации данных соответствующим уравнением. Скорость окисления и реакционные промежуточные соединения также могут быть определены с использованием режима двойного смешивания стоп-флоу в данной реакции с AF Sid A. Промежуточное соединение C four A Hydroxi flavin четко обнаруживается с λmax 380 нм, а окисленный фермент имеет λmax 450 нм.
После освоения эта методика может быть выполнена за четыре-шесть часов при условии правильного соблюдения протокола. Не забудьте убедиться, что растворы являются анаэробными. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как исследовать как относительные, так и изъязвляющие ионы FLA-независимого моно для последующих экспериментов, таких как экспресс-химический анализ.
Метод Квентина может помочь прояснить природу промежуточных соединений.
Обзор
В данном исследовании используется прибор с остановленным потоком для анализа восстановительной и окислительной полуреакций сидерофора А (SidA) Aspergillus fumigatus, который представляет собой флавин-зависимую монооксигеназу. Работа включает спектральный анализ промежуточных продуктов реакции и расчет констант скоростей их образования.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биохимия
- Энзимология
- Спектроскопия
Теоретические сведения
- Aspergillus fumigatus является значимым грибковым патогеном.
- Сидерофор A (SidA) играет ключевую роль в поглощении железа.
- Флавин-зависимые монооксигеназы важны для различных биохимических реакций.
- Понимание механизмов реакций может помочь в разработке стратегий борьбы с грибковыми инфекциями.
Цель исследования
- Для изучения механизмов реакции SidA.
- Для измерения констант скорости реакций промежуточных соединений.
- Для получения новых данных о каталитическом цикле флавин-зависимых ферментов.
Используемые методы
- Спектроскопия с остановленным потоком для быстрого смешивания и спектрального анализа.
- Создание анаэробных условий для ферментативных реакций.
- Измерение спектральных изменений во времени для определения кинетики реакции.
- Использование специфических буферов и реагентов для обеспечения протекания реакций.
Основные результаты
- Идентификация различных спектральных форм SidA в ходе реакций.
- Расчет констант скорости образования промежуточных продуктов реакции.
- Демонстрация каталитического цикла с участием NADP и кислорода.
- Характеристика переходных промежуточных соединений в пути реакции.
Заключение
- Метод остановленного потока эффективен для изучения кинетики ферментов.
- Полученные данные могут быть полезны для дальнейших исследований флавин-зависимых ферментов.
- Результаты способствуют пониманию метаболизма грибов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Спектрофотометрия с остановкой потока позволяет проводить точный кинетический анализ реакций флавин-зависимых монооксигеназ, что способствует снижению механистических рисков и валидации мишеней на ранних этапах поиска. Благодаря разделению восстановительных и окислительных полуреакций, а также количественному определению переходных промежуточных соединений, данный подход повышает точность прогнозов для портфелей препаратов, нацеленных на ферменты. Адаптивность метода к другим флавин-зависимым системам делает его универсальным инструментом для биофармацевтических исследований и разработок.&Конвейеры D.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках&D
Ранний поиск и валидация мишеней
- Позволяет напрямую измерять внутренние константы скорости для проверки механистических гипотез.
- Обеспечивает идентификацию и характеристику каталитических интермедиатов для функциональной валидации мишеней.
- Способствует снижению биологических рисков за счет выяснения путей ферментативных реакций.
- Повышает прогностическую уверенность при продвижении ферментативных мишеней в портфелях по поиску новых лекарственных средств.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает валидированные спектральные показатели для стандартизации и воспроизводимости анализа.
- Позволяет количественно отслеживать окислительно-восстановительные состояния фермента для надежной оценки соединений.
- Поддерживает подготовку стабильных биологических систем для последующих этапов скрининга.
- Позволяет повторно использовать платформу для различных мишеней флавин-зависимых монооксигеназ.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет механизмы действия с соответствующими ферментными системами при заболеваниях, где это применимо.
- Обеспечивает преемственность от кинетической валидации на этапе поиска до выбора доклинических моделей.
- Обосновывает решения по продвижению препаратов с учетом рисков путем уточнения каталитических механизмов.
- Поддерживает разработку трансляционных биомаркеров за счет количественного определения промежуточных продуктов.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Этот метод применяется на стыке этапов раннего поиска и идентификации ведущих соединений, обеспечивая понимание механизмов действия до перехода к доклиническим исследованиям.
- Биология открытий: поддерживает проверку гипотез и уточнение путей реакций путем разрешения редукционных и окислительных полуреакций.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные спектральные данные для подготовки анализа.
- Аналитика: позволяет измерять константы скорости и обнаруживать переходные промежуточные соединения для сравнительного анализа.
- Трансляционные исследования: связывает выводы о механизмах действия с выбором доклинической модели в случаях, когда ферменты-мишени имеют значение для патологии заболевания.
- Корпоративное повторное использование: предлагает стандартизированный рабочий процесс, адаптируемый к другим флавин-зависимым монооксигеназам.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность при валидации ферментарных мишеней.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизированные, воспроизводимые и масштабируемые кинетические измерения.
- Стратегическая ценность: Позволяет принимать обоснованные решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и проводить экономически эффективную сортировку портфеля.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритезацию с учетом рисков и продвижение активов, нацеленных на ферменты.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области энзимологии и анализа кинетических данных.
- Необходим доступ к спектрофотометру с остановленным потоком и инфраструктуре для работы в анаэробных условиях.
- Требуется строгая стандартизация приготовления буферов и калибровки приборов между исследовательскими группами.
- Метод может быть адаптирован для различных флавин-зависимых монооксигеназных систем при условии соответствующей оптимизации.
- Точность измерения полуреакции зависит от поддержания строгих анаэробных условий.
Часто задаваемые вопросы о биофармацевтике
Chapters in this video
0:05
Title
1:37
Anaerobic Buffer
2:24
Removing Oxygen from the Stopped-flow System
3:22
Key Solutions
4:45
Reductive Half-reaction: Monitoring Flavin Reduction
7:31
Oxidative Half-reaction: Monitoring Flavin Oxidation
10:10
Stopped Flow: Spectral Forms of Af SidA
11:27
Conclusion
