Перепрограммирование соматических клеток человека в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПСК) Использование ретровирусных вектор с GFP

Общая цель этой процедуры заключается в получении человеческих IPS-клеток посредством ретровирусно-опосредованной сверхэкспрессии OCT 4, SOX 2K LF 4 и M с помощью репортерной системы GFP. Это достигается путем добавления соответствующего количества индивидуального GFP, экспрессирующего ретровирус. Затем инфицированные вирусом клетки, экспрессирующие GFP, переносятся в пластины, покрытые 0,1% желатином, с эмбриональными фибробластами мыши.

Третьим этапом процедуры является замена среды на среду для культивирования эмбриональных стволовых клеток человека. Наконец, изолированы замолчавшие GFP колонии IPS, которые демонстрируют морфологию, сходную с человеческими эмбриональными стволовыми клетками. В конечном счете, результаты показывают экспрессию эндогенных плюрипотентных маркеров посредством иммунофлуоресцентного окрашивания и R-T-Q-P-C-R.

Основным преимуществом данной методики из существующих методов, таких как окрашивание по образу жизни плюрипотентным поверхностным маркером и наблюдение за морфологическими изменениями, является желанный iPad. Клеточные колонии могут быть легко изолированы, используя потерю экспрессии GFP в качестве маркера для плюрипотентных клеток. Фибробласты человека в среде фибробластов за сутки до инфицирования один раз от 10 до пятой части фибробластов человека в одну лунку из шести лунок планшета на следующий день аспирируют среду для удаления мертвых клеток и добавляют два миллилитра свежей фибробластной среды с пятью микрограммами на миллилитр сульфата протамина.

Затем осторожно добавьте соответствующее количество каждого вируса, экспрессирующего GFP, соответствующее кратности инфекции из пяти. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи через день после заражения. Удалите вирусную надосадочную жидкость три раза двумя миллилитрами PBS.

Затем добавляют два миллилитра, фибробласты среды через три дня после заражения. Проверьте флуоресценцию GFP и пополните лунку на два миллилитра. Фибробластную среду на следующий день наносят один раз по 10 на четыре на квадратный сантиметр облученных мышиных, эмбриональных фибробластов или фидерных клеток фибробластов в фибробластную среду на 10-сантиметровую чашку Петри, покрытую 0,1% желатином.

Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия на ночь. На следующий день отделите инфицированные человеческие фибробласты с одним миллилитром 0,05% трипзина ЭДТА в течение пяти минут при 37 градусах Цельсия и центрифугируйте в течение пяти минут при 200 G. Ресуспендируйте клетки в 10 миллилитрах фибробластной среды и повторите работу клеток на предварительно покрытых 0,1% желатине с МФС. Спустя 24 часа.

Замените среду питательной средой HESC и меняйте среду ежедневно. ЭСК-подобные колонии начнут появляться через 20-27 дней после заражения после появления ЭСК-подобных колоний под флуоресцентным микроскопом. Проверьте отсутствие флуоресценции GFP в колонии, которая демонстрирует морфологию, сходную с ГСК.

С помощью пипетки объемом 10 микролитров. Выберите отдельные колонии IPSC и поместите их в одну лунку из 12-луночной пластины, покрытой желатином и метамфетамином и дополненной средой HESC. Меняйте среду ежедневного прохождения клеток, промывая пластину одним миллилитром DMM F 12.

Затем добавьте 0,5 миллилитра коллагеназы и выдерживайте 10 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Дважды промойте ячейки с помощью DM A MF 12. Далее добавьте два миллилитра свежей среды HESC.

Затем с помощью подъемника клеток разбить колонии на мелкие кусочки и отделить оставшиеся клетки от пластины. Переложите ресуспендированные кусочки колоний в одну лунку с желатиновым покрытием и покрытыми MEF шестью лунками. Хорошо закалывают и выдерживают при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух суток.

Проверить клетки методом иммунофлюоресценции. Вымойте их три раза PBS и зафиксируйте 4%-ным паральдегидом на 20 минут при комнатной температуре. Аккуратно промойте клетки три раза PBS и пропитайте их 0,2% триттон X 100 в PBS в течение 30 минут.

Блокируйте неспецифическое связывание путем инкубации клеток с 3% БСА в PBS в течение двух часов. Затем инкубируйте клетки с первичным антителом в течение ночи при четырех градусах Цельсия. Затем клетки трижды промывают PBS и инкубируют их со вторичными антителами в течение одного часа при комнатной температуре в темноте.

Во время последней промывки трижды промойте ячейки PBS. Добавьте даппи и выдерживайте при комнатной температуре в течение пяти минут. Визуализируйте клетки с помощью флуоресцентного микроскопа для количественного измерения в режиме реального времени.

ПЦР изолируют общую РНК из ИПК человека, полученных из фибробластов человека. Использование набора для выделения РНК. Синтезируйте кДНК первой цепи с помощью обратной транскриптазы.

Затем используйте его в качестве шаблона для QPCR для обнаружения генов плюрипотентности. Фибробласты человека, BJ 1, которые были инфицированы коктейлем ретровирусов, несущих OCT 4, SOX 2, KLF 4 и Mick, показанные здесь, являются морфологическими изменениями, наблюдаемыми во время перепрограммирования с пятого дня. В сегодняшних 10, 14 и 21 годах клетки начинают проявлять морфологию, подобную HESC, через 21 день, а ИПК распознаются флуоресценцией GFP.

Плюрипотентные стволовые клетки, такие как ЭСК и ИПК, экспрессируют молекулярный механизм для подавления экспрессии провирусных генов. Тем не менее, используемые здесь ретровирусные векторы экспрессируют GFP вместе с перепрограммированием генов с помощью ретровирусного LTR. Таким образом, считается, что клетки, непрерывно экспрессирующие GFP, экспрессируют трансгены без сайленсинга провирусных генов, как видно здесь, перепрограммированные колонии IPSC, которые приобретают молекулярную сеть плюрипотентности, демонстрируют отсутствие экспрессии GFP.

На этом рисунке показан иммуногистохимический анализ колоний, полученных из фибробластов Detroit 5, 51 с антителами к TRA 180 1, TRA one 60, SSEA 4, T four и nano, как можно успешно видеть. Перепрограммированные ИПК экспрессируют все эти маркеры. Кроме того, был проведен количественный R-T-P-C-R для анализа экспрессии генов, который показал, что T 4 SOX two, KLF 4 M и nano были значительно увеличены по сравнению с родительскими клетками фибробластов, но соизмеримы с таковым у H 9 HSCs.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как заразить вирус, идентифицировать и подобрать полностью запрограммированные на губу IPA-клетки с помощью флуоресцентной микроскопии.