Флуоресценции микроскопии Скрининг и следующего поколения секвенирования: Полезные инструменты для идентификации генов, вовлеченных в органелл Integrity

Целью данного эксперимента является идентификация гена или генов, отвечающих за морфологическую и функциональную целостность органелл растений. Это достигается путем добавления сульфоната метана Ethel в качестве химического агента к мутагенным семенам атопии, несущим флуоресцентный маркер органеллы. Второй шаг — сбор семян с отдельных растений первого мутагенного поколения для выращивания линий последующего мутантного поколения М два.

Затем мутаген А семена элианы наблюдают с помощью конфокального или флуоресцентного микроскопа для определения аберрантного органного фенотипа. Заключительным этапом является генерация третьего поколения мутагена и подтверждение наличия мутантного фенотипа. В конечном счете, рецессивная мутация может быть картирована с помощью инструментов секвенирования нового поколения.

После того, как местоположение мутантного гена определено, трансформация с помощью гена дикого типа должна восстановить аберрантный органный фенотип. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в поддержании морфологической и функциональной целостности органелл растений. Метаны Атил, обработка сульфонатами семян ста вызывают изменения времени цитозина в геноме, что приводит к увеличению времени цитозина.

Добавление мутаций. Лечение EMS является ключевым шагом в этом протоколе для обеспечения идеального соотношения мутаций внутри М двух человек. Для начала приобретите семена арабидопсиса дикого типа Columbia Ecotype, которые ранее были сконструированы для переноса соответствующего флуоресцентного маркера органеллы.

Переложите 0,8 грамма или около 40 000 семян в 50-миллилитровую соколиную трубку. Затем добавьте 25 миллилитров дистиллированной воды и 0,2% сульфоната метана Ethel. После инкубации инкубируйте смесь в течение 16 часов на мутирующем миксере на низкой скорости, отасуньте жидкость и спустите ее в слоеницу, содержащую один молярный гидроксид натрия.

Чтобы инактивировать EMS, добавьте 25 миллилитров воды в пробирку Falcon, содержащую семена. Закройте трубку и переверните пять раз, чтобы промыть семена. После того, как все семена осядут, отсадите воду и скиньте в одну колбу с гидроксидом натрия.

Повторяйте этот этап промывки до 10 раз после окончательной промывки, Риз проведите семена в минимальном количестве воды. Приступайте к стерилизации семян, добавив 25 миллилитров 10% отбеливателя и энергично встряхивая в течение 30 секунд. Как только семена осядут на дно, слейте хлорную известь и промойте 25 миллилитрами стерильной воды.

После удаления стерильной воды добавьте 25 миллилитров 70% этанола. Встряхните трубочки в течение 30 секунд и дайте семенам осесть на дно. Слейте этанол и смойте 25 миллилитрами стерильной воды.

Повторите промывание стерильной водой дважды. Затем высыпьте семена на пластиковую чашку Петри, содержащую фильтровальную бумагу толщиной три мм. Дайте семенам высохнуть под колпаком после инкубации семян в течение двух дней при четырех градусах Цельсия.

Поместите семена в 150-миллиметровую чашку Петри в соотношении примерно от 250 до 300 семян на тарелку пополам Magi и смочите среду, содержащую гель для истребителей. В качестве желеобразователя выращивайте семена поколения М1 на тарелках в течение двух недель. Пересадите рассаду в почву и дайте растениям продолжить рост.

Через 30-45 дней растения достигнут зрелой стадии, когда созреют, поэтому утечки будут хорошо видны. На этом этапе соберите М два семени с отдельных растений М1, чтобы получить 1000 независимых М двух линий. Для того чтобы понаблюдать за рассадой с помощью конфокального или флуоресцентного микроскопа, выращивайте по 60 семян из каждой М двух линий в течение 7-10 дней на пластиковых чашках Петри пополам.

Морейш и скуг среда, содержащая истребительный гель, также выращивают пять саженцев необработанного контроля ЭМС на той же тарелке. После того, как саженцы будут выращены, установите от 5 до 10 cos подводящих отверстий с уплотнительной стороной ABAC по направлению к 40-кратному объективу на предметное стекло микроскопа и закройте покровным стеклом под флуоресценцией, наблюдайте за каждым олеином от корковой до медиальной области на предмет измененного субклеточного распределения маркера органелл. После пересадки положительных растений в почву и выращивания, которые сеянцы, как только что описано, подтверждают, что мутантный фенотип находится в М третьем поколении.

Удалите загрязняющие фоновые мутации путем обратного скрещивания не менее трех раз с геномом дикого типа, содержащим желаемый органический флуоресцентный маркер, как описано в письменном протоколе. Чтобы начать картирование, используйте мини-набор растений cogen DN Easy Z для извлечения примерно трех микрограммов геномной ДНК из M three, которая представляет гомозиготную мутантную ДНК Columbia. Отправьте эту ДНК на второй анализ генома Illumina для секвенирования по 14 градусов.

Следующим шагом будет скрещивание мутанта заго Колумбия Уилл Лас Бергер для получения одного потомства после самоопыления, в котором может произойти комбинация. В результате будет получено поколение глухих зубов, которое в конечном итоге послужит картирующей популяцией, содержащей интересующий ген, вызывающий мутацию. Сравнивая геномную ДНК этой популяции с геномной ДНК растений хорошего типа, можно определить место мутации в геноме.

После роста двух растений F соберите от 70 до 100 F двух особей с аберрантным фенотипом и такое же количество F двух растений с фенотипом дикого типа, соберите по листовому диску с каждого растения с помощью целого перфоратора. Листовой диск следует собирать из листьев того же возраста. Чтобы обеспечить одинаковое количество ДНК, образцы могут быть обработаны для геномной экстракции по отдельности или в группах.

В этом случае можно собрать от 5 до 10 образцов для каждой пробирки, чтобы было меньше пробирок, из которых приходится извлекать геномную ДНК. Используйте набор для очистки чистой ДНК листьев растений master pure plant для извлечения геномной ДНК. Геномная ДНК, полученная из каждого образца, может быть количественно определена с помощью NanoDrop.

Затем, объединив равное количество ДНК из каждого образца до 300 нанограммов, разделяя образцы мутантного и дикого типов, чтобы сначала вызвать реакцию мечения, добавьте 60 микролитров 2,5 случайного раствора праймера и 42 микролитра воды. После денатурации ДНК при температуре более 95 градусов Цельсия в течение 5-10 минут вызовите образцы на льду, чтобы денатурировать ДНК. Добавьте 15 микролитров 10 X DN tps.

Смешайте с биотином DCTP и дополните тремя микролитрами. Глен-полимераза. Инкубируйте образцы в течение ночи при температуре 25 градусов Цельсия.

На следующий день добавьте 15 микролитров трехмолярного ацетата натрия и 400 микролитров холодного 100% этанола. Инкубируйте смешанные образцы при температуре минус 80 градусов Цельсия в течение одного часа после центрифугирования при температуре 20 500 раз G в течение 15 минут. Промойте гранулу 500 микролитрами холодного 75% этанола после второго отжима.

Высушите гранулы ДНК при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут. Повторно суспендируйте гранулы в 100 микролитрах воды и используйте пять микролитров для проверки выхода и качества гелевого био. Первичные реакции случайного мечения загружали на 1%-ный гель из пула диких растений типа F два и из пула мутантных растений типа F два.

В качестве заключительного шага отправьте 95 микролитров реакции маркировки дикого типа и мутантной маркировки для гибридизации генного чипа arabidopsis с помощью одного геномного массива. После сканирования ластиком, полученные файлы полученных точечных CL анализируются с помощью нашего программного обеспечения. После установки нашего программного обеспечения откройте программу и вставьте строку биопроводника, найденную в письменной процедуре.

Затем нажмите клавишу ввода, которая установит стандартные пакеты BIOCONDUCTOR с сайта массива, генотипирования и картирования. Загрузите и распакуйте файлы, перечисленные в тексте, в новую папку на рабочем столе. Останутся данные, полученные в эксперименте с генетическим чипом для диких типов C, L и мутантных C. Теперь скопируйте данные о генных чипах для дикого типа C и мутантных C в папку.

Затем откройте R для ПК. Нажмите кнопку Файл, а затем нажмите кнопку Изменить директорию. Выберите папку, содержащую файлы, нажмите «Загрузить файл в рабочую область», а затем выберите A one V Five R data open read C do R с помощью блокнота и скопируйте весь текст в R для Mac, нажмите mis, а затем нажмите «Изменить рабочий каталог».

Выберите папку, содержащую файлы. Нажмите workspace load workspace file и выберите ATH one V five R data. Аналогично откройте SFP R и MAP R с помощью текста, отредактируйте и скопируйте текст в R в окне консоли.

Появится сообщение о поиске генов на информационном ресурсе Arabidopsis или TAIR. Скопируйте и вставьте ссылку, найденную в тексте, в интернет-браузер. Появится окно с просьбой открыть или сохранить файл.

Выберите «Сохранить». Выберите имя файла и прикрепите расширение. Сделай х лс.

Затем нажмите «Сохранить». Здесь показан типичный ожидаемый результат. После анализа данных, полученных с помощью массива генов Arabidopsis H one, на этом рисунке представлен пример картирования мутации Columbia zero с использованием генного чипа Arabidopsis, гибридизации генома H one, где горизонтальные полосы представляют пороги для обнаружения.

Мутация в данном примере расположена на хромосоме, ограниченной вертикальными полосами. Откройте файл dot XLS, чтобы найти координаты мутанта в отображаемой области. В собранных Illumina чтениях мутантного генома идентифицировать специфические EMS-переходы среди однонуклеотидных полиморфизмов.

После освоения подхода, описывающего этот протокол, можно будет использовать для картирования гена на три коротких временных интервала по сравнению с классическим методом картирования.