Измерение активности фактора V в плазме крови человека с помощью анализа микропланшетов коагуляции

Общей целью данной процедуры была разработка микропланшетного анализа, который измеряет активность фактора белка свертывания V во время образования фибринового сгустка в плазме крови человека. В ответ на травму активируется процесс свертывания крови, что приводит к серии реакций превращения ксимогена в протеазу, которые в конечном итоге приводят к образованию фермента свертывания крови тромбина, растворимого фибриногена в мономеры фибрина, которые затем связываются с образованием нерастворимого фибринового сгустка. В норме кровь остается в виде свободно текущей жидкости в здоровом или неповрежденном состоянии, а количество образующегося фибрина равно количеству фибрина в разложенном или расщепленном состоянии.

Тем не менее, в некоторых болезненных ситуациях слишком большое свертывание крови приводит к сердечным заболеваниям и инсульту, в то время как слишком малое свертывание приводит к склонности к кровотечениям, которые часто наблюдаются при гемофилии. Фактор V представляет собой белок в плазме, который в своей активированной форме фактор 5 А является критическим ускорителем образования тромбина во время образования фибринового сгустка в составе протромбинового ферментного комплекса, протромбин состоит из четырех компонентов фактора 10 А, протеазного фактора 5 А, кофактора липида, поверхности и кальция. Мелиновый фактор 5 А увеличивает каталитическую эффективность или kcat фактора 10 А по отношению к его субстрату протромбину примерно в 3000 раз, тем самым значительно усиливая образование тромбина и образование фибриновых сгустков.

Платформа микропланшетов предпочтительна для измерения событий, катализируемых ферментами, из-за удобства, временных затрат, небольших объемов образцов, непрерывного мониторинга и высокой производительности. Событие образования фибринового сгустка можно контролировать с помощью считывателя микропланшетов путем измерения увеличения поглощения света плазмой по мере ее изменения от прозрачного желтого вида без фибринового сгустка и минимального поглощения света до непрозрачного мутного вида с фибриновым сгустком и максимальным поглощением света. Основными преимуществами этого метода по сравнению с существующими методами, такими как ручные анализы с наклонной трубкой или анализы с помощью автоматических анализаторов, является то, что метод является быстрым, недорогим, имеет небольшие требования к объему образца и обладает высокой пропускной способностью.

В ходе анализа измеряется активность непреднамеренно активированного и активируемого тромбином фактора 5 для получения полной количественной оценки его общей функциональной активности. Демонстрировать эту технику будет Дерек Тилли, студент магистратуры в лаборатории. Для того чтобы измерить активность фактора 5 в образце плазмы, необходимо построить фактор 5 одностадийной активности, стандартные кривые времени образования фибринового сгустка в панели А и начальную скорость образования фибринового сгустка в панели В, используя нормальную человеческую плазму или NHP в качестве стандарта, который по определению содержит одну единицу фактора 5 Активность на мл размораживания дефицитной плазмы Фактора 5. Нормальная плазма крови человека, а также образец плазмы неизвестен и тромбопластин при температуре 37 градусов в течение 10 минут.

Аккуратно перемешайте фактор пять дефицита плазмы и тромбопластику, переложите в отдельные пластиковые моечные лотки и инкубируйте на льду. Храните нормальную человеческую плазму и образцы неизвестной плазмы на льду после осторожного перемешивания. Храните хлорид кальция 25 миллимоляр в дистиллированной воде в отдельном моечном лотке при комнатной температуре с коэффициентом пять одна стадия активности стандартных кривых.

Приготовьте по 200 мкл каждый из двухкратных серийных разбавлений нормальной плазмы крови человека от 0, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 1, 28, 2, 56 и 512 раз при ХБД рН 7,4 с помощью микроцентрифужных пробирок объемом 1,5 мл, заворкируйте лунку и инкубируйте на льду. Для образца плазмы неизвестного образца приготовьте по 200 микролитров каждый из 40-кратных разведений нормальной плазмы крови человека и неизвестного образца плазмы при pH 7,4 HBS с использованием микроцентрифужных пробирок объемом 1,5 мл. Поместите пять полосок микролунок в держатель шаблона считывателя микропланшетов.

Включите считыватель микропланшетов и получите доступ к прикладному программному обеспечению Softmax Pro для микропланшетов с помощью многоканальной пипетки. С помощью одной пипетки произвести одновременное добавление 50 мклитров дефицитной плазмы фактора пять во все лунки микропланшета образца, добавить 50 микролитров приготовленных 10 последовательных разведений нормальной плазмы крови человека и 40-кратных разведений нормальной плазмы человека и неизвестных образцов плазмы для разделения лунок MICROPLATE с помощью многоканальной пипетки, добавить 50 микролитров тромбопластики во все лунки образца. Инкубируйте в считывателе Microplate при температуре 25 градусов Цельсия в течение одной минуты, встряхивая в течение 15–25 секунд из одной минуты инкубации.

С помощью компьютера, сопряженного со считывателем MICROPLATE, можно получить доступ к прикладному программному обеспечению Softmax Pro Microplate. Установите считыватель микропланшетов в режим длины волны поглощения 405 нанометров и кинетическую температуру 25 градусов Цельсия и запрограммируйте считыватель микропланшетов на встряхивание в течение первых пяти секунд после добавления хлорида кальция и измеряйте поглощение на 405 нанометрах каждые пять секунд в течение шести минут. После этого пятисекундный интервал встряхивания не включается в расчетное время закусывания с помощью двух многоканальных пипеток одновременно добавляют 50 микролитров хлорида кальция в две микропланшетные полоски с образцами.

Подождите 15 секунд и сразу же нажмите на значок запуска в Softmax Pro с компьютера, чтобы начать анализ. Для каждого анализируемого образца плазмы определяется время образования тромба, которое определяется как время в секундах для достижения половины максимального увеличения поглощения. Начальная скорость образования тромба определяется как скорость увеличения поглощения в течение первых пяти временных точек линейной части увеличения поглощения во времени.

Степень образования тромба определяется как разница между максимальной и минимальной абсорбцией, достигнутой во время образования тромба в конце прогона. Используйте профили зависимости поглощения от времени в Softmax Pro для определения времени, начальной скорости и степени образования тромбов при серийном разведении нормальной плазмы человека. Чтобы построить стандартные кривые активности одной стадии с фактором V, используйте время сгустка для 40-кратно разбавленной нормальной плазмы человека и образца плазмы неизвестных, чтобы я интерполировал фактор 5 активности в единицах на миллу от стандартной кривой активности одной стадии с фактором пять.

Это представляет собой фактор пять, одну стадию активности или активность без преднамеренной активации тромбином. Это типичный пример образования фибринового сгустка в анализе фактора пять с течением времени, полученном с помощью считывателя микропланшетов. Профиль представляет собой образование фибринового сгустка с использованием 32-кратно разбавленной нормальной плазмы человека в одной микропластине.

Что ж, вертикальная ось обозначает изменение абсорбента на 405 нанометров, которое произошло в результате образования фибринового сгустка. Время образования тромба было рассчитано как средняя точка кривой зависимости поглощения от времени, 36,4 секунды. Исходная скорость образования тромба была рассчитана как 611,88 миллиединиц в минуту.

Степень образования облаков была рассчитана как 0,35 единицы. Пятифакторный анализ точно измеряет начальную скорость и степень образования облаков. Обследование скважин после завершения анализа подтвердило, что образование тромбов произошло.

Все реакции достигали примерно одинаковой степени CloudFormation с общим изменением поглощения на 405 нанометрах от 0,35 до 0,45 единиц между начальной абсорбцией до и максимальной абсорбцией после тромбопластики и хлорида кальция. В качестве дополнения можно привести репрезентативные примеры одностадийной активности фактора пять, стандартной кривой времени образования тромба в секундах против фактора 5 активности в единицах на мил и начальной скорости образования когтей в миллиединицах в минуту по сравнению с фактором пять. Активность в единицах на мил для нормальной человеческой плазмы показана на панели А и панели В соответственно.

Так как фактор пять в норме активируется с помощью тромбина. Второй анализ активного кофактора 5 А после добавления и инкубации с тромбином имеет решающее значение для точного измерения двухступенчатой активности образца плазмы фактора пять с преднамеренной активацией путем добавления тромбина для двухэтапного анализа фактора пять. Приготовьте от 200 до 300 микролитров очищенного тромбина при его конечной концентрации в сто наномоляров при pH 7,4 HBS и инкубируйте на льду, разведите 120 микролитров сверхнормы человеческой плазмы и возьмите образец плазмы от 40 до 100 раз с 170 микролитрами HBS pH 7,4, содержащим 2,8 миллимоляра.

Хлорид кальция. Добавьте 10 микролитров тромбина для достижения конечной концентрации 10 наномоляров в каждый образец. Вихрь. Хорошо перемешать и инкубировать при 37 градусах В течение одной минуты разбавить нормальную человеческую плазму и образец плазмы до 500 раз, добавив 400 микролитров HBS pH 7,4.

Определите время свертывания для нормальной плазмы крови человека в каждом из неизвестных плазменных анализов по профилям зависимости поглощения от времени в soft max Pro. Принимая во внимание 500-кратное разбавление, используйте время сгустка для каждого образца для расчета фактора пять двухступенчатой активности от фактора пять одноступенчатой стандартной кривой зависимости времени сгустения от активности. Это представляет собой фактор пять, двухступенчатую активность или активность с преднамеренной активацией тромбином.

Общая активность с фактором пять может быть рассчитана как фактор пять двухступенчатой деятельности минус фактор пять одностадийной активности. Стандартная кривая времени логарифмического тромба в зависимости от активности логарифмического фактора 5 была использована для измерения активности фактора 5 в нормальной плазме человека и в плазме девяти пациентов с диссеминированным внутрисосудистым свертыванием или ДВС-синдромом, все девять пациентов с ДВС-синдромом. Проявлена одностадийная активность фактора 5 и начальные темпы образования тромбов, которые были снижены в среднем на 54 и 18%Фактор пять, две стадии и общая активность были снижены у пациентов с ДВС-синдромом в среднем на 44 и 42% по сравнению с нормальной плазмой крови человека.

Фактор 5 и пациенты с ДВС-синдромом привели к увеличению времени и снижению скорости образования тромбов волокон. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как реализовать этот метод в вашей лаборатории. Метод может быть легко адаптирован для измерения активности любого фактора свертывания крови в плазме, что делает его пригодным для широкого спектра исследований и клинических применений.

В конечном счете, эта информация о факторе V положительно повлияет на среду здравоохранения благодаря ранней диагностике и лечению тромботических или свертывающих расстройств, таких как ДВС-синдром.