Измерение активности фактора V в плазме крови человека с помощью анализа микропланшетов коагуляции

Общая цель следующей процедуры заключалась в разработке микропланшетного анализа для измерения активности белка свертывания крови — фактора V — в процессе образования фибринового сгустка в плазме крови человека. В ответ на повреждение активируется процесс свертывания крови, который представляет собой серию реакций превращения зимогенов в протеазы, что в конечном итоге приводит к образованию фермента свертывания тромбина; тромбин расщепляет растворимый фибриноген до мономеров фибрина, которые затем объединяются с образованием нерастворимого фибринового сгустка. В норме, при отсутствии повреждений, кровь остается свободно текучей жидкостью, а количество образующегося фибрина равно количеству распадающегося или разрушающегося фибрина.

Однако при некоторых заболеваниях чрезмерное свертывание приводит к сердечно-сосудистым заболеваниям и инсульту, тогда как недостаточное свертывание приводит к склонности к кровотечениям, что часто наблюдается при гемофилиях. Фактор V представляет собой белок плазмы, который в своей активированной форме (фактор V A) является критически важным ускорителем генерации тромбина при формировании фибринового сгустка в составе протромбиназного комплекса; протромбиназный комплекс состоит из четырех компонентов: фактора X A (протеаза), фактора V A (кофактор), липидной поверхности и кальция. Фактор V A увеличивает каталитическую эффективность или kcat фактора X A по отношению к его субстрату протромбину примерно в 3000 раз, тем самым значительно усиливая генерацию тромбина и формирование фибринового сгустка.

Платформа с использованием микропланшетов предпочтительна для измерения ферментативных реакций благодаря удобству, временным затратам, малым объемам образцов, возможности непрерывного мониторинга и высокой пропускной способности. Процесс формирования фибринового сгустка можно отслеживать с помощью планшетного ридера, измеряя увеличение оптической плотности плазмы по мере ее перехода из прозрачного желтого состояния (без сгустка фибрина и с минимальным поглощением света) в непрозрачное мутное состояние с образованием фибринового сгустка и максимальным поглощением света. Основными преимуществами данного метода по сравнению с существующими способами, такими как ручной метод с наклоном пробирок или анализы с использованием автоматических анализаторов, являются высокая скорость, низкая стоимость, малые требования к объему образца и высокая пропускная способность.

Данный анализ позволяет измерить активность непреднамеренно активированного и активированного тромбином фактора V для получения полной количественной оценки его общей функциональной активности. Технику будет демонстрировать Дерек Тилли, магистрант лаборатории. Чтобы измерить активность фактора V в образце плазмы, необходимо построить одностадийные стандартные кривые активности фактора V: времени образования фибринового сгустка на панели A и начальной скорости образования фибринового сгустка на панели B, используя в качестве стандарта нормальную плазму человека (NHP), которая по определению содержит одну единицу активности фактора V на mL. Разморозьте плазму с дефицитом фактора V, нормальную плазму человека, исследуемые образцы плазмы и тромбопластин при 37 °C в течение 10 минут.

Осторожно перемешайте плазму с дефицитом фактора V, перенесите ее в отдельные пластиковые промывочные кюветы и инкубируйте на льду. После осторожного перемешивания храните нормальную человеческую плазму и исследуемые образцы плазмы на льду. Хлорид кальция 25 мM в дистиллированной воде для построения стандартных кривых одностадийной активности фактора V храните в отдельной промывочной кювете при комнатной температуре.

Приготовьте по 200 µL двукратных серийных разведений нормальной плазмы человека в HBS pH 7.4 в разведениях 0, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 1:28, 2:56 и 512 раз, используя микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл; тщательно перемешайте на вортексе и выдержите на льду. Для определения неизвестных образцов плазмы приготовьте по 200 µL 40-кратных разведений нормальной плазмы человека и плазмы неизвестных образцов в HBS pH 7.4, используя микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл. Поместите пять стрипов с микролунками в держатель-шаблон микропланшетного ридера.

Включите микропланшетный ридер и запустите программное обеспечение Softmax Pro для микропланшетного анализа. С помощью многоканального дозатора одновременно внесите по 50 µL плазмы с дефицитом фактора V во все лунки микропланшета с образцами. С помощью одноканального дозатора внесите по 50 µL подготовленных 10 серийных разведений нормальной плазмы человека, 40-кратных разведений нормальной плазмы человека и исследуемых образцов плазмы в отдельные лунки микропланшета. С помощью многоканального дозатора добавьте по 50 µL тромбопластина во все лунки с образцами. Инкубируйте в микропланшетном ридере при 25 °C в течение одной минуты, обеспечив перемешивание в интервале от 15 до 25 секунд в течение этой минуты инкубации.

С помощью компьютера, подключенного к микропланшетному ридеру, запустите программное обеспечение Softmax Pro Microplate. Установите в настройках ридера длину волны поглощения 405 нм, кинетический режим и температуру 25 °C. Запрограммируйте прибор на перемешивание в течение первых пяти секунд после добавления хлорида кальция и измерение оптической плотности при 405 нм каждые пять секунд в течение шести минут. После этого пятисекундный интервал перемешивания не включается в расчетное время свертывания. Используя две многоканальные пипетки одновременно, внесите по 50 µL хлорида кальция в две стрипы микропланшета с образцами.

Подождите 15 секунд и немедленно нажмите значок запуска в программе Softmax Pro на компьютере, чтобы начать анализ. Для каждого анализируемого образца плазмы определяется время образования сгустка, которое определяется как время в секундах до достижения половины максимального увеличения абсорбции. Начальная скорость образования сгустка определяется как скорость увеличения абсорбции за первые пять временных точек линейного участка зависимости увеличения абсорбции от времени.

Степень образования сгустка определяется как разница между максимальным и минимальным значениями абсорбции, достигнутыми в ходе процесса формирования сгустка в конце анализа. Используйте профили зависимости ABSORBENCE от времени в программе Softmax Pro для определения времени, начальной скорости и степени образования сгустка для серийных разведений нормальной плазмы крови человека. Для построения калибровочных кривых одноэтапной активности фактора V используйте время свертывания для нормальной плазмы человека в 40-кратном разведении и неизвестных образцов плазмы, чтобы интерполировать активность фактора V в единицах на мл по калибровочной кривой одноэтапной активности фактора V.

Это представляет собой активность фактора V на одной стадии или без преднамеренной активации тромбином. Это типичный пример формирования сгустка фибрина в анализе на фактор V с течением времени, полученный с помощью планшетного ридера. Профиль отражает формирование сгустка фибрина при использовании нормальной плазмы крови человека в 32-кратном разведении в одном микропланшете.

Вертикальная ось обозначает изменение оптической плотности при 405 нанометрах, произошедшее в результате образования сгустка фибрина. Время образования сгустка было рассчитано как средняя точка кривой зависимости оптической плотности от времени и составило 36,4 секунды. Начальная скорость образования сгустка была рассчитана и составила 611,88 миллиединиц в минуту.

Степень образования помутнения была рассчитана и составила 0,35 единиц. Анализ «фактор пять» точно измеряет начальную скорость и степень образования помутнения. Осмотр лунок по завершении анализа подтвердил образование сгустка.

Во всех реакциях была достигнута примерно одинаковая степень свертывания с общим изменением абсорбции при 405 нанометрах в диапазоне от 0,35 до 0,45 единиц между начальным значением абсорбции до и максимальным значением после тромбопластина и хлорида кальция. Типичные примеры одноэтапной активности фактора V, калибровочная кривая времени свертывания в секундах в зависимости от активности фактора V в единицах на мл и начальная скорость образования сгустка в миллиединицах в минуту в зависимости от активности фактора V в единицах на мл для нормальной плазмы крови человека показаны на панели A и панели B соответственно.

Поскольку фактор V в норме активируется тромбином, для точного измерения двухэтапной активности фактора V в образце плазмы требуется проведение второго анализа после добавления тромбина и инкубации с ним с целью преднамеренной активации. Для проведения двухэтапного анализа фактора V приготовьте 200–300 µL очищенного тромбина с конечной концентрацией 100 nM в буфере HBS pH 7.4 и выдержите на льду. Разведите 120 µL нормальной плазмы человека и исследуемых образцов плазмы в соотношении от 40 до 100 раз, добавив 170 µL буфера HBS pH 7.4, содержащего 2.8 mM.

Хлорид кальция. Добавьте 10 µL тромбина в каждый образец, чтобы достичь конечной концентрации 10 nM. Перемешайте содержимое лунки на вортексе и инкубируйте при 37 °C в течение одной минуты, затем разведите нормальную человеческую плазму и плазму образцов в 500 раз, добавив 400 µL HBS pH 7.4.

Определите время свертывания для нормальной плазмы человека в каждом из анализов с неизвестными образцами плазмы по профилям зависимости абсорбции от времени в программе SoftMax Pro. С учетом 500-кратного разведения, используйте время свертывания для каждого образца, чтобы рассчитать двухэтапную активность фактора V по одноэтапной стандартной кривой зависимости времени свертывания от активности фактора V. Это значение представляет собой двухэтапную активность фактора V или активность при намеренной активации тромбином.

Затем общая активность фактора V может быть рассчитана как разница между активностью фактора V в двухэтапном тесте и активностью фактора V в одноэтапном тесте. Стандартная кривая зависимости логарифма времени свертывания от логарифма активности фактора V использовалась для измерения активности фактора V в нормальной плазме крови человека и в плазме девяти пациентов с disseminated intravascular coagulation или ДВС-синдромом. У всех девяти пациентов с ДВС-синдромом активность фактора V в одноэтапном тесте и начальная скорость формирования сгустка были снижены в среднем на 54% и 18% соответственно. Активность фактора V в двухэтапном тесте и общая активность у пациентов с ДВС-синдромом были снижены в среднем на 44% и 42% по сравнению с нормальной плазмой человека.

Фактор V и образцы пациентов с ДВС-синдромом привели к увеличению времени и снижению скорости образования фибринового сгустка. После просмотра этого видео у вас должно появиться четкое представление о том, как внедрить этот метод в вашей лаборатории. Данный метод можно легко адаптировать для измерения активности любого фактора свертывания в плазме, что делает его подходящим для широкого спектра исследовательских и клинических применений.

В конечном итоге эти сведения о факторе V окажут положительное влияние на систему здравоохранения, обеспечив более раннюю диагностику и лечение тромботических или геморрагических нарушений, таких как ДВС-синдром.