Одноклеточный профилирования развивающихся и зрелых нейронов сетчатки

Общая цель данной процедуры заключается в изоляции отдельных клеток для анализа транскриптома с помощью микрочипов. Это достигается путем предварительного отделения сетчатки от окружающих тканей с последующей диссоциацией ее на отдельные клетки. На втором этапе осуществляется сбор одиночных клеток и их помещение в ПЦР-пробирки с лизирующим буфером.

Затем клетки лизируют, и кДНК амплифицируют с помощью обратной транскрипции с последующим проведением полимеразной цепной реакции. В конечном итоге для выявления мРНК, экспрессируемых в одной клетке, используется гибридизация одноклеточной кДНК на микрочипе A iMatrix. Основным преимуществом профилирования экспрессии генов в отдельных клетках по сравнению с методами анализа цельной ткани является то, что изоляция единичных клеток позволяет получить доступ к очень малым популяциям клеток, из которых состоит вся ткань.

Эти клетки могут быть чем угодно: от различных типов нейронов до небольших популяций стволовых клеток. Метод анализа единичных клеток позволяет нам определять типы этих клеток, выявлять специфические маркеры для данных малых популяций, а также идентифицировать генные сети, экспрессируемые в этих крайне редких подмножествах клеток. Кроме того, метод профилирования единичных клеток позволяет выявлять генные сети, которые транзиторно экспрессируются в ходе очень динамичных переходов в процессе развития в очень малых подмножествах клеток.

Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области генетики развития, например, когда клетки-предшественники начинают экспрессировать генные сети, связанные с дифференцировкой, и чем эти клетки-предшественники отличаются друг от друга. Значимость этой методики распространяется на клеточную терапию нейродегенеративных заболеваний, таких как глаукома, поскольку выяснение ключевых сетей в развитии отдельных клеток приближает нас к возможности генерировать такие клетки для использования в заместительной клеточной терапии. Начните процедуру, поместив сетчатку мыши в чашку с PBS.

Затем удалите стекловидное тело и хрусталик. После этого удалите весь ретинальный пигментный эпителий. Инкубируйте сетчатку в микроцентрифужной пробирке объемом 1.5 мл при 37 °C в течение 10 минут.

После этого осторожно постучите по пробирке, чтобы взвесить осевшие клетки. Затем аккуратно тритурите содержимое от 10 до 20 раз с помощью дозатора P 1000. Если крупные фрагменты ткани сохраняются, инкубируйте образец еще в течение 10 минут при 37 °C и повторно тритурируйте его 10–20 раз.

Затем добавьте пять мкл днк, при концентрации 10 ед/мкл, в ретину и инкубируйте в течение пяти минут при комнатной температуре. После этого снова аккуратно перемешайте содержимое с помощью дозатора P 1000 еще 10–20 раз. Центрифугируйте при 3000 об/мин в течение трех минут.

Затем удалите супернатант, оставив на дне от 100 до 200 µL жидкости. Постуките по пробирке, чтобы разбить осадок. Далее добавьте 1 mL HBSS и ресуспендируйте осадок путем осторожного перемешивания.

Центрифугируйте образец при 3000 RPM в течение трех минут. По завершении осторожно удалите супернатант. Затем ресуспендируйте осадок в 450 µL PBS, содержащего 0,1% BSA; на следующем этапе подготовьте две чашки диаметром 6 см, содержащие 5 mL PBS с добавлением 0,1% BSA.

Затем высейте диссоциированные клетки в одну чашку. Дайте клеткам осесть в течение как минимум пяти минут. После этого поместите чашку с диссоциированными клетками под инвертированный микроскоп.

Используйте тонкую пипетку с аспирационной трубкой, чтобы собрать одну клетку. Поднесите микропипетку близко к клетке, и она легко попадет внутрь за счет капиллярного эффекта. Затем вынесите клетку на вторую чашку, убедившись, что для профилирования экспрессии генов собрана только одна клетка.

Это выполняется либо путем удаления лишних клеток, либо путем перемещения интересующей клетки в другое место с помощью новой микропипетки. Когда отдельная клетка будет полностью изолирована от соседних клеток, используйте новую микропипетку, чтобы аспирировать интересующую клетку. Затем вытолкните ее непосредственно в ПЦР-пробирку объемом 0.2 milliliter, содержащую 4.5 microliters буфера для лизиса клеток.

Кратковременно центрифугируйте образец в микроцентрифуге, чтобы клетка была полностью погружена в буфер для лизиса. Повторяйте центрифугирование после каждой пятой клетки, а также в конце сбора. Помните, что на протяжении всего процесса изоляции отдельных клеток пробирку необходимо держать на льду; для достижения оптимальных результатов данной процедуры сбор одиночных клеток следует провести в течение двух часов после диссоциации. Кратковременно центрифугируйте образец в микроцентрифуге, чтобы убедиться, что отдельная клетка погружена в буфер для лизиса клеток.

Для стимуляции лизиса клеток инкубируйте образец в термоциклере при 70 °C в течение 90 секунд. Затем немедленно поместите пробирку обратно на лед на две минуты. Для проведения обратной транскрипции добавьте 0.33 µL.

Добавьте Superscript three в концентрации 200 units per microliter в объеме 0,05 microliters, ингибитор в концентрации 40 units per microliter в объеме 0,07 microliters, а также T four gene 32 protein в пробирку. Инкубируйте реакционную смесь в термоциклере в течение 50 minutes при 50 °C; по истечении 50 minutes инактивируйте фермент при 70 °C в течение еще 15 minutes.

После этого снова поместите пробирку на лед. Для удаления свободного праймера добавьте в пробирку 0,1 мкл 10-кратного буфера для экзонуклеазы, 0,8 мкл H2O и 0,1 мкл экзонуклеазы (в концентрации 20 units per microliter), затем инкубируйте смесь при 37 °C в течение 30 минут в термоциклере.

Через 30 минут инактивируйте фермент, инкубируя реакционную смесь при 80 °C в течение 25 минут. По завершении снова поместите пробирку на лед. Затем добавьте шесть µL смеси для реакции достройки хвоста в образец.

Инкубируйте смесь в термоциклере при 37 °C в течение 20 минут, при 70 °C в течение 10 минут, а затем храните при 4 °C. После этого добавьте 10 µL образца с присоединенными адаптерами в реакционную смесь для ПЦР. Проведите синтез второй цепи и ПЦР-амплификацию для маркировки кДНК.

Для обеспечения надежной гибридизации на микрочипах iMatrix сначала фрагментируйте cDNA, добавив от 10 до 20 µL cDNA одной клетки к 8 µL 1x FormAI-буфера. Затем добавьте 1 µL этой разведенной ДНК в 80 µL реакционного раствора. Далее добавьте к нему 20 µL 5x TdT-буфера, 2.5 µL биотинилированного dATP и 1 µL разведенной TdT.

Затем добавьте к смеси 20 µL буфера XTDT, 2,5 µL биотина, 6 µL dDATP и 1 µL TDT. Инкубируйте смесь в течение 90 минут при 37 °C, затем в течение 5 минут при 65 °C.

Впоследствии храните образец при -20 °C или сразу проведите гибридизацию с микрочипом a iMatrix. Здесь представлен типичный пример мазков cDNA единичных клеток и ген-специфичных ПЦР: в дорожках A, F, G, N и H наблюдаются выраженные мазки cDNA, тогда как в дорожках B, C, D и E они значительно менее выражены. cDNA были выделены из флуоресцентных ганглионарных клеток сетчатки, а затем протестированы с помощью ПЦР-праймеров, специфичных для маркеров ганглионарных клеток сетчатки BRN3B и PAX6, а также ген-специфичной ПЦР для маркера фоторецепторов.

CRX использовали для определения уровня контаминации в отдельной клетке. кДНК и подмножества ганглионарных клеток сетчатки идентифицировали путем скрининга на наличие гена tachy kinin one. Результаты микрочипирования для выбранных генов, экспрессируемых в 22 различных одиночных клетках, представлены в виде тепловой карты.

Интенсивность сигналов микрочипа была масштабирована в соответствии с интенсивностью красного цвета, в то время как черный цвет указывает на отсутствие сигнала на микрочипе. После проведения этой процедуры можно использовать дополнительные методы, такие как QPCR, для подтверждения паттерна экспрессии генов, выявленного с помощью микрочипа. Результаты гибридизации с C также могут быть использованы для получения ответов на дополнительные вопросы о локализации клеток, экспрессирующих определенные гены.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить диссоциацию сетчатки, выделять единичные клетки и синтезировать кДНК из этих единичных клеток для последующей гибридизации на микрочипе.