Одноклеточный профилирования развивающихся и зрелых нейронов сетчатки

Общая цель этой процедуры заключается в выделении отдельных клеток для анализа транскриптома на основе микрочипов. Это достигается путем сначала рассечения сетчатки от окружающих тканей, а затем ее диссоциации на отдельные клетки. Второй шаг заключается в сборе отдельных клеток и помещении их в ПЦР-пробирки, содержащие буфер для лизиса.

Затем клетки лизируются и КДНК амплифицируется с помощью обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией. В конечном счете, гибридизация CD NA одной клетки на микрочипе A iMatrix используется для выявления мРНК, экспрессируемых в одной клетке. Основное преимущество профилирования экспрессии генов в отдельных клетках по сравнению с использованием подходов с цельными тканями заключается в том, что выделение отдельных клеток позволяет получить доступ к очень небольшим популяциям клеток, которые будут составлять всю ткань.

Эти клетки могут быть чем угодно, от различных типов нейронов до небольших популяций стволовых клеток. Метод одиночных клеток позволяет нам идентифицировать оба типа клеток, специфические маркеры для этих небольших популяций клеток, а также идентифицировать генные сети, которые экспрессируются в этих чрезвычайно редких подмножествах клеток. Кроме того, метод профилирования одиночных клеток позволяет нам идентифицировать генные сети, которые временно экспрессируются во время очень динамичных переходов развития в очень малых подмножествах клеток.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области генетики развития, например, когда клетки-предшественники начинают экспрессировать генные сети, связанные с дифференцировкой, и чем эти клетки-предшественники отличаются друг от друга. Применение этого метода распространяется на клеточную терапию нейродегенеративных заболеваний, таких как глаукома, потому что, выясняя ключевые сети в развитии отдельных клеток, мы становимся на шаг ближе к возможности генерировать эти клетки для использования в клеточной заместительной терапии. Начните эту процедуру с помещения сетчатки мыши в чашку, наполненную PBS.

Далее снимите стекловидное тело и хрусталик. Затем удалите весь пигментный эпителий сетчатки. Инкубируйте сетчатку глаза в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 миллилитра при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут.

После этого осторожно постучите по трубке, чтобы выбить все осевшие клетки. Затем осторожно протрите его от 10 до 20 раз с помощью пипетки P 1000. Если большие комки ткани сохраняются, инкубируйте ее еще 10 минут при температуре 37 градусов Цельсия и охладите от 10 до 20 раз.

Далее добавьте в сетчатку пять микролитров ДНК, по одному из 10 единиц на микролитр, и инкубируйте ее в течение пяти минут. При комнатной температуре триер осторожно измерьте его с помощью пипетки P 1000 еще 10-20 раз. Центрифугируйте его при 3000 об/мин в течение трех минут.

Затем удалите надосадочную жидкость и оставьте на дне от 100 до 200 микролитров жидкости. Постучите по трубке, чтобы выбить гранулу. Далее добавьте один миллилитр HBSS и повторно суспендируйте гранулу с легким тированием.

Центрифугируйте его при 3000 об/мин в течение трех минут. Когда это будет сделано, осторожно удалите надосадочную жидкость. Затем восстановите, суспензируйте его в 450 микролитрах PBS, содержащем 0,1% BSA, на следующем этапе приготовьте два шестисантиметровых блюда, содержащих пять миллилитров PBS с добавлением 0,1% BSA.

Далее тарелка, диссоциированные клетки на одну тарелку. Дайте клеткам отстояться не менее пяти минут. После этого поместите чашку с диссоциированными клетками под перевернутый микроскоп.

Используйте пипетку с тонким наконечником и аспираторной трубкой для забора одной клетки. Затем поместите микропипетку близко к клетке, и она легко войдет в микропипетку с помощью капиллярного воздействия. Затем переместите клетку во вторую чашку и убедитесь, что для профилирования экспрессии генов собрана только одна клетка.

Это делается либо путем удаления посторонних клеток, либо перемещения интересующей клетки в другое место с помощью новой микропипетки. Когда отдельная клетка будет полностью изолирована от соседних клеток, используйте новую микропипетку для аспирации интересующей клетки. Затем изгоните его непосредственно в 0,2-миллилитровую ПЦР-пробирку, содержащую 4,5 микролитра буфера для лизиса клеток.

Кратковременно открутите образец в микроцентрифуге, чтобы погрузить клетку в буфер для лизиса. Проделывайте это вращение после каждой пятой ячейки, а затем еще раз в конце сбора. Не забывайте держать пробирку на льду в течение всего времени выделения одиночных клеток и соберите отдельные клетки в течение двухчасового окна после диссоциации для достижения оптимальных результатов в этой процедуре, кратковременно вращайте образец в микроцентрифуге, чтобы убедиться, что одиночная клетка погружена в буфер для лизиса клеток.

Чтобы стимулировать лизис клеток, инкубируйте образец при температуре 70 градусов Цельсия в течение 90 секунд в термоциклере. Затем сразу же поместите трубку обратно на лед на две минуты. Чтобы выполнить обратную транскрипцию, добавьте 0,33 микролитра.

Надстрочный индекс три при 200 единицах на микролитр 0,05 микролитра, ингибитор при 40 единицах на микролитр и 0,07 микролитра. Т четыре гена 32 белка к трубке. Через 50 минут инкубируйте реакционную смесь при температуре 50 градусов Цельсия в амплификаторе, через 50 минут инактивируйте фермент при температуре 70 градусов Цельсия еще на 15 минут.

Когда это будет сделано, поместите трубку обратно на лед. Для удаления свободного праймера добавьте 0,1 микролитра 10 х экзонуклеазного буфера, 0,8 микролитра, D H2O и 0,1 микролитра. Экзонуклеазу, одну по 20 единиц на микролитр, в пробирку инкубируют при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут в термоамплификаторе.

Через 30 минут инактивируйте фермент, инкубируя реакционную смесь при 80 градусах Цельсия в течение 25 минут. В конце поместите трубку обратно на лед. Далее добавьте в образец шесть микролитров хвостовой реакционной смеси.

Выдержите его в термоамплификаторе при температуре 37 градусов Цельсия в течение 20 минут, 70 градусов Цельсия в течение 10 минут, а затем держите при температуре четыре градуса Цельсия. Впоследствии добавьте 10 микролитров хвостатого образца в реакционную смесь ПЦР. Выполните синтез второй цепи и амплификацию ПЦР для мечения CDNA.

Для получения робастной гибридизации на iMatrix микрочипы сначала фрагментируют CD NA, добавляя от 10 до 20 микролитров CD NA одной клетки к восьми микролитрам один x один для всех буферов. Затем добавьте один микролитр этой разведенной ДНК в 80 микролитровый реакционный раствор. Далее добавьте в него 20 микролитров, пять буферов XTDT, 2,5 микролитра биотина, а также шесть D-D-A-T-P и один микролитр разведенного TDT.

Далее добавьте в него 20 микролитров, пять буферов XTDT, 2,5 микролитра, биотин, а также шесть D-D-A-T-P и один микролитр TDT. Выдерживайте смесь в течение 90 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Затем пять минут при 65 градусах по Цельсию.

Впоследствии храните его при температуре минус 20 градусов Цельсия или немедленно гибридизируйте с микрочипом iMatrix. Ниже приведен типичный пример мазков CD NA и геноспецифических линий ПЦР A-F-G-N-H содержат устойчивые мазки CD NA, в то время как дорожки B, C, D и E значительно менее надежны. КДНК были выделены из флуоресцентных ганглиозных клеток сетчатки, а затем были протестированы с использованием ПЦР-праймеров, специфичных для маркеров ганглиозных клеток сетчатки, BRN 3 B и PAC 6, ген-специфической ПЦР для маркера фоторецептора.

CRX использовали для определения уровня загрязнения в одиночной клетке. КДНК и подмножества ганглиозных клеток сетчатки были идентифицированы с помощью скрининга на наличие гена тахикинина. Результаты микрочипов для выбранных генов, экспрессированных в 22 различных одиночных клетках, показаны в формате тепловой карты.

Интенсивность сигналов микрочипа была масштабирована в соответствии с интенсивностью красного цвета, в то время как черный указывает на отсутствие сигнала на микрочипе. После этой процедуры можно использовать дополнительные методы, такие как КПЦР, для подтверждения паттерна экспрессии генов, наблюдаемого на микрорентгеновском снимке. Результаты С-гибридизации также могут быть использованы для ответа на дополнительные вопросы, которые могут возникнуть у вас о расположении клеток, экспрессирующих определенные гены.

После просмотра этого видео у вас должно быть довольно хорошее представление о том, как диссоциировать сетчатку, изолировать отдельные клетки и генерировать CDNA из этих отдельных клеток. Для гибридизации на микрочипе.