Локальные и глобальные методы оценки теплового ноцицепции в Drosophila Личинки

Общая цель данного эксперимента заключается в анализе термической ноцицепции у личинок дрозофилы. Это достигается путем сбора личинок дрозофилы с их последующим воздействием на вредоносные тепловые стимулы. В качестве дополнительного второго этапа личинок можно подвергнуть УФ-облучению, которое вызывает повреждение тканей и сенсибилизацию термической ноцицепции. Далее личинок можно исследовать локально с помощью теплового зонда или глобально с использованием нагревательной пластины, чтобы вызвать ноцицептивные реакции, которые можно количественно измерить.

С помощью теплового зонда было показано, что ноцицептивный ответ личинок на тепло имеет определенный порог, а также выявлена неожиданная зависимость между температурой воздействия и амплитудой вызванного ответа. Тест с нагревательной пластиной демонстрирует, что личинки проявляют стереотипную последовательность ноцицептивных поведенческих реакций, которые зависят от температуры окружающей воды и активности ноцицептивных сенсорных нейронов. Описанные здесь методы могут помочь ответить на ключевые вопросы в области термической ноцицепции, например, различается ли реакция животных на вредоносные тепловые стимулы при их локальном или глобальном воздействии.

Как правило, специалистам, которые впервые используют метод теплового зонда, бывает трудно освоить данную процедуру, так как для минимизации вариаций давления, места и угла наклона зонда требуется практика. Визуальная демонстрация анализа на тепловой пластине имеет решающее значение, поскольку для полноценного понимания необходимо видеть поведенческие реакции, вызванные повышением температуры. Чтобы получить достаточное количество личинок-потомков интересующего генотипа, выращивайте необходимый штамм напрямую или проведите скрещивания в флаконах с кормом для мух, используя от 20 до 30 неспарившихся самок и от 15 до 20 самцов. Через пять дней после откладки яиц соберите и очистите личинок ранней третьей instar, удалив мягкий корм и промыв их под слабой струей воды через сито с размером пор 630 micron. Перенесите личинок ранней третьей instar на небольшую влажную подушечку из корма, чтобы предотвратить их голодание и высыхание.

После сборки камеры для авторизации с помощью пинцета или кисти аккуратно поместите 10 личинок раннего третьего возраста вдоль внутренней стороны крышки и закройте ее. Работая в вытяжном шкафу, поместите камеру для авторизации внутрь соединительной банки, в которой находится стакан объемом 10 мл с ватным тампоном, смоченным 1.5 мл этилового эфира. Закрутите крышку соединительной банки, чтобы личинки подвергались воздействию паров эфира в течение 2–2.5 минут.

После проведения анестезии извлеките камеру для анестезии из сосуда Коплана и подождите несколько секунд в вытяжном шкафу, чтобы остатки паров эфира испарились. С помощью бутылки с дистиллированной водой аккуратно промойте личинок из камеры для анестезии в небольшой чашку Петри. Промокните анестезированных личинок насухо, затем осторожно зафиксируйте их дорсальной стороной вверх на полоске двустороннего скотча, закрепленной на предметном стекле размером три на один дюйм.

Поместите предметное стекло на нижнюю поверхность камеры УФ-облучения и подвергните личинок воздействию УФ-излучения в течение шести секунд при интенсивности 20 millijoules per centimeter squared. После облучения погрузите стекло в воду, чтобы аккуратно отделить личинок от двустороннего скотча. С помощью пинцета или кисти осторожно перенесите облученные личинки в контейнер размером 15 by 45 millimeter.

Стеклянный культуральный флакон объемом 1 драм, содержащий один миллилитр корма для мух, чтобы оставить личинок восстанавливаться в течение от 8 до 24 часов при 25 °C или желаемой температуре культивирования перед повторным переносом. Для анализа термической ноцицепции сначала установите температуру термического зонда на нужное значение. С помощью кисти или пинцета осторожно перенесите отдельную личинку на плоскую платформу, убедившись, что личинка покрыта тонким слоем воды.

Для минимизации колебаний давления, а также для обеспечения правильного расположения и угла наклона температурного датчика, необходима соответствующая практика. Осторожно прижмите кончик датчика к личинке в области четвертого сегмента А, оказывая легкое давление под углом примерно 45 градусов между датчиком и поверхностью тела личинки. Давление должно вызвать небольшое вдавление поверхности личинки, чего обычно достаточно для предотвращения ее передвижения.

Продолжайте стимулировать личинок до появления реакции отстранения или до достижения 22-го контрольного значения. Личинки, проявляющие ответную реакцию, обычно сначала демонстрируют предварительное поведение в виде поднятия головы и хвоста, за которым следует реакция отстранения в виде переката минимум на 360 градусов. Как только началась реакция отстранения, прекратите контакт с зондом и зафиксируйте латентный период или время, затраченное на отстранение.

Если в течение 20 секунд реакция отстранения не наблюдается, личинка считается не отвечающей. Расположите волоконно-оптические световоды так, чтобы обеспечить достаточное высококонтрастное освещение. Для наблюдения за личинками поместите нагревательный блок в термопластину плоской поверхностью вверх, а затем установите термопластину на основание микроскопа.

Включите нагревательную плитку в режим высокого нагрева и подождите примерно 15 минут, пока температура не стабилизируется на отметке 95 °C. Отмерьте 80 µL дистиллированной воды и с помощью микропипетки нанесите каплю воды в центр полистирольной чашки Петри размером 60 × 15 мм. С помощью пинцета осторожно поместите чистую личинку средней трети instar в центр капли воды, стараясь добавить как можно меньше лишней воды.

Осторожно поместите чашку Петри на твердый нагревательный блок плитки. Быстро отрегулируйте положение чашки так, чтобы вся личинка и капля воды находились в поле зрения. Запустите таймер.

В данный момент чашка Петри помещается на твердый нагревательный блок нагревательной плиты, и фиксируется время начала каждого поведенческого акта. При переносе личинки, погруженной в воду, на нагревательную плиту наблюдаются стереотипные локомоторные реакции. Нормальное поведение в отсутствие нагрева характеризуется зонтикообразным передвижением, сопровождаемым поисковыми движениями головы.

Затем может наблюдаться поведение, характеризующееся «биением головы», при котором личинка быстро перемещает голову вперед или в стороны. Эти движения напоминают их обычное передвижение в воде, но носят более прерывистый характер и сопровождаются постоянным вращением. Данное поведение регистрируется, когда личинка совершает боковой перекат по крайней мере на полные 360 градусов.

Это может происходить переменное количество раз и иногда сопровождаться неполными переворотами. Для оценки поведения учитывайте только полные перевороты на 360 градусов. Данное поведение наиболее похоже на ту сцену с локальным применением теплового зонда во время «хлыстообразного» поведения.

Личинка демонстрирует быстрые сократительно-расслабляющие движения вдоль передне-задней оси, в результате чего голова на очень короткое время приближается к хвосту. Хлыстообразные движения часто наблюдаются серией по два или одновременно с перекатами. В завершение личинка проявляет судорожное поведение, за которым часто следует паралич. Во время судорожного поведения личинка вытягивается вдоль передне-задней оси и демонстрирует высокочастотные колебания всего тела.

Дрожащее поведение без паралича сгибания наблюдается, когда личинки прекращают движение. У некоторых личинок это состояние становится постоянным, тогда как другие затем проявляют низкочастотные пульсирующие движения. На данном графике процента респондеров, относящихся к каждой категории, виден предел термической ноцицептивного ответа личинок. В тесте с тепловым зондом 100% личинок являются быстрыми респондерами при температуре зонда до 52 °C.

Однако при температуре 54 °C и выше 90% или более личинок не реагируют даже после 20 секунд контакта. Хотя эти личинки продолжают двигаться после 22-го порога отсечки, также можно измерить и построить график количества перекатов или времени, затраченного на поведение избегания (отстранения). Примечательно, что наблюдается обратная зависимость между температурой зонда и выраженностью реакции, так как более низкие температуры, по-видимому, вызывают большее количество перекатов.

При переносе личинки, погруженной в воду, на нагревательную пластину наблюдаются пять стереотипных локомоторных реакций. Здесь представлены средние значения латентного периода для этих реакций, а также средние температуры капли воды, измеренные для каждого периода при оптимальных условиях анализа; процент личинок, проявляющих каждое из этих специфических поведенческих актов, варьировался от 77 до 100%, хотя иногда перекатывание и хлестообразные движения могут отсутствовать, перекрывать друг друга или происходить в обратном порядке; здесь также указан процент личинок, выживших после начала паралича в ходе анализа на нагревательной пластине. Личинок нагревали до наступления паралича, после чего переносили в стандартные условия культивирования для восстановления.

Личинки ложно-обработанной группы подвергались аналогичным процедурам, за исключением воздействия тепла; количественная оценка формирования PPE у жизнеспособных взрослых особей проводилась с седьмого по тринадцатый день. В данной работе MD G four индуцирует экспрессию регулируемых UAS-трансгенов во всех четырех классах мультидендритных периферических сенсорных нейронов. UAS or one delta C экспрессирует модифицированную версию открывающегося выпрямляющего калиевого канала drosophila, необходимого для синаптической передачи, а UAS orrc one delta NC экспрессирует дополнительно модифицированную версию того же канала, которая не препятствует синаптической передаче.

Обратите внимание, что только личинки, несущие одновременно драйвер MD GAL4 и трансген UAS ORC delta C, демонстрируют увеличение латентного периода для четырех из пяти наблюдаемых поведенческих реакций. После просмотра этого видео у вас должно сформироваться четкое представление о том, как измерять локальные и глобальные ответы личинок Drosophila на вредоносные тепловые стимулы. Эти процедуры можно сочетать с другими методами, такими как генетический анализ, для идентификации генов, необходимых для тепловой ноцицепции. При проведении теста с тепловым зондом важно помнить о необходимости минимизировать вариативность давления, местоположения и угла контакта зонда.