Флуоресцентные Анализ Скрининг на выявление каналов модуляторы GIRK
24 апреля 2012 г.
В режиме реального времени процедура скрининга для выявления наркотиков, которые взаимодействуют с G белком закрытый внутренний выпрямитель K + (GIRK) каналов описана. Анализ использует мембранный потенциал-чувствительные флуоресцентные красители для измерения GIRK канал деятельности. Этот метод можно адаптировать для использования на нескольких клеточных линий.
Общая цель данной процедуры заключается в выявлении новых препаратов, модулирующих каналы grk. Это достигается путем предварительной гальванизации ячеек A TT 20 в 96-луночной пластине. Вторым этапом является разбавление испытуемых соединений с помощью системы обработки жидких пластин Verset.
Далее разведенные тестовые соединения наносятся на клетки с помощью стихода. Заключительным этапом является вставка 96-луночной пластины в считыватель двух флуоресцентных планшетов Synergy и закачка контрольных растворов и растворов соматостатина в лунки. В конечном счете, считыватель флуоресцентных пластин используется для отображения соединений, которые изменяют индуцированный соматостатином флуоресцентный сигнал и, таким образом, модулируют каналы Grk.
Преимущество этой процедуры по сравнению с существующими методами, такими как запись с помощью патч-клэмпа, заключается в том, что большое количество соединений может быть быстро проверено, чтобы определить, модулируют ли они каналы герка. Применение этого метода распространяется на лечение боли, поскольку соединения, активирующие канал Gerk, что приводит к ингибированию ноцицептивной передачи FI, могут быть идентифицированы. Пластины на 96 лунок и облицовку ячеек выполняет Марибель Васкес.
Студент в моей лаборатории: Начните эту процедуру с выращивания клеток гипофиза A TT 20 в DMEM с добавлением 10% лошадиной сыворотки при температуре 37 градусов Цельсия во влажной атмосфере с 5% CO2. Поддерживайте культуру, выращивая клетки каждые пять-семь дней с использованием стандартной процедуры изационизации. Далее смажьте колодцы черным прозрачным цветом.
Дно 96 лунки планшета с 50 микролитрами поли Л лизина. Дайте лункам высохнуть в течение 30 минут в инкубаторе. Затем удалите избыток поли-L лизина планшетом с клетками в 96-луночный планшет, содержащий 200 микролитров среды с плотностью 30 000 клеток на лунку.
После этого хранить клетки в инкубаторе в течение трех-четырех дней. Используйте аспирационную установку для медленной аспирации питательной среды из монослоя клеток, затем промойте клетки 200 микролитрами обычного буферного раствора. Впоследствии добавьте по 200 микролитров буферного раствора, содержащего мембранный потенциал-чувствительный краситель к каждому.
Хорошо инкубируйте клетки в течение 40 минут при температуре 37 градусов по Цельсию. Через 40 минут извлеките клетки А ТТ 20 из инкубатора и дайте им вернуться к комнатной температуре, отсасывайте из старого буфера. Затем нанесите на клетки свежий буферный раствор, содержащий MPD.
Затем с помощью системы обработки жидкостей можно подать на клетки различные концентрации исследуемых соединений и контрольных растворов. В 96-луночном планшете инкубируют клетки в течение пяти минут с тестовыми соединениями до флуоресцентных измерений. В этой процедуре вставьте 96-луночный планшет в биотехнологический считыватель с двумя флуоресцентными планшетами.
Получение флуоресцентного фонового сигнала на длине волны экссудации 520 нанометров и длине волны миссии 560 нанометров. После этого нанесите лиганды G PCR R или контрольный раствор на лунки для активации каналов GIR с помощью системы двух нагнетателей Synergy. Затем соберите точки данных с интервалом в десять секунд в течение 302-го периода выборки.
На длинах волн возбуждения и излучения. Рассчитайте Z-фактор, чтобы определить надежность анализа. Z.Факторы в диапазоне от 0,5 до 1,0 указывают на то, что качество анализа отличное.
Пластины с коэффициентом Z ниже 0,5 не учитываются. Из проведенного анализа получены соединения, которые модулируют флуоресцентный сигнал, повторно протестированные в присутствии двух миллимолярных хлоридов бария или 500 наномолярных терапина Q для подтверждения специфичности калиевого канала внутрь выпрямителя, показанной здесь репрезентативный флуоресцентный сигнал HLB 0 2 1 1 15 2, измеренный с течением времени в клетках A TT 20 с добавлением соматостатина или контрольного раствора. Отношение интенсивности флуоресценции по оси Y рассчитывали путем деления сигнала в присутствии соматостатина или контрольного раствора на исходный сигнал, измеренный до добавления соматостатина или контрольного раствора.
Здесь показано лечение клеток A TT 20 с 500 наномолярами. Терапин Q ингибирует опосредованное соматостатином снижение флуоресцентного сигнала, связываясь с двумя и блокируя G-каналы. Здесь показано лечение клеток A TT 20 20 микромолярным пропафеноном, который также ингибирует опосредованное соматостатином снижение флуоресцентного сигнала.
После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как определить препараты, модулирующие каналы grk с помощью считывателя флуоресцентных пластин.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описывается процедура скрининга в режиме реального времени для идентификации препаратов, взаимодействующих с G-белок-зависимыми калиевыми каналами внутреннего выпрямления (GIRK). В анализе используются чувствительные к мембранному потенциалу флуоресцентные красители для измерения активности GIRK-каналов, что позволяет адаптировать метод для различных клеточных линий.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Фармакология
- Нейробиология
- Электрофизиология
Введение
- Каналы GIRK играют ключевую роль в нейронной сигнализации.
- Идентификация модуляторов каналов GIRK может привести к разработке новых терапевтических стратегий.
- Анализы в режиме реального времени повышают эффективность скрининга лекарственных средств.
- Флуоресцентные красители обеспечивают чувствительное измерение активности каналов.
Цель исследования
- Разработать методику скрининга препаратов, модулирующих GIRK-каналы.
- Использовать высокопроизводительный формат для тестирования нескольких соединений.
- Углубить понимание фармакологии GIRK-каналов.
Используемые методы
- Посев клеток TT 20 в 96-луночный планшет.
- Разведение исследуемых соединений с помощью системы автоматического дозирования Verset.
- Нанесение разведенных соединений на клетки с помощью системы Verset.
- Измерение отклика с использованием флуоресцентного планшетного ридера Synergy two.
Основные результаты
- Идентификация соединений, изменяющих сигналы, индуцированные соматостатином.
- Демонстрация адаптивности метода анализа к различным клеточным линиям.
- Успешная модуляция активности GIRK-каналов тестируемыми соединениями.
- Подтверждение эффективности флуоресцентного планшетного ридера при проведении скрининга.
Выводы
- Разработанный анализ является ценным инструментом для поиска лекарственных препаратов, воздействующих на GIRK-каналы.
- Скрининг в реальном времени может ускорить идентификацию потенциальных терапевтических средств.
- Необходимы дальнейшие исследования для изучения клинического значения выявленных соединений.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Данный анализ позволяет осуществлять высокопроизводительную идентификацию модуляторов GIRK-каналов, что способствует валидации мишеней в нейробиологии и при разработке сердечно-сосудистых препаратов. Обеспечивая количественный считываемый сигнал флуоресценции в режиме реального времени, этот метод снижает зависимость от низкопроизводительной электрофизиологии и ускоряет переход от стадии поиска хитов к оптимизации соединений-лидеров. Метод повышает прогностическую достоверность на ранних этапах разработки, связывая воздействие соединений с функциональной активностью каналов в физиологически релевантном клеточном контексте.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем измерения функциональной модуляции каналов GIRK в ответ на лиганды GPCR.
- Операционная ценность: обеспечивает быстрый скрининг библиотек соединений для идентификации активаторов или ингибиторов с механистической специфичностью.
- Прогностическая ценность: способствует снижению рисков при выборе мишени, подтверждая таргетную активность посредством изменений флуоресцентного сигнала, коррелирующих с выходом K+.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: использование красителей, чувствительных к мембранному потенциалу (DiBAC4(3) или HLB 021-152), позволяет получать количественные сигналы в режиме реального времени при активации GIRK.
- Воспроизводимость: расчет Z-фактора (отличный диапазон: 0.5–1.0) обеспечивает надежность анализа для отбора хитов и воспроизводимость кампании по скринингу.
- Масштабируемость: совместимость с 96-луночным форматом и системами дозирования жидкостей (например, Verset) для автоматизированного распределения соединений и скрининга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для медицины: Выявленные модуляторы могут лечь в основу терапевтических стратегий лечения нейропатической боли, зависимостей и сердечных аритмий посредством GIRK-опосредованного торможения нейронов.
- Трансляционная преемственность: Флуоресцентный анализ обеспечивает переход от взаимодействия с мишенью к функциональному результату, что способствует закреплению фенотипа на доклиническом этапе.
- Механистическое снижение рисков: Специфичность подтверждалась с использованием таких ингибиторов, как хлорид бария или Terapin Q, для дифференциации GIRK-опосредованных эффектов от побочной активности.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный анализ вписывается в континуум поиска новых соединений — от валидации мишени до идентификации лида, позволяя проводить функциональный скрининг модуляторов GIRK перед последующей оптимизацией.
- Открывательная биология: способствует проверке гипотез путем установления связи между активацией GPCR и GIRK-зависимыми изменениями флуоресценции, что позволяет прояснить модуляцию сигнального пути.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа за счет стандартизированного введения красителя, нанесения соединений и кинетического измерения флуоресценции в течение 300 секунд.
- Аналитика: позволяет получать количественные измерения зависимой переменной (отношения интенсивности флуоресценции) для сравнения активности и эффективности соединений.
- Трансляционные исследования: связаны с доклинической работой посредством идентификации соединений, которые изменяют возбудимость нейронов через GIRK, что актуально для моделей боли и зависимости.
- Корпоративное повторное использование: платформа адаптируема для различных клеточных линий и лигандов GPCR, что способствует ее повторному применению в рамках нескольких кампаний по валидации мишеней.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: обеспечивает достоверность прогнозов модуляции мишени за счет снижения механистической неопределенности при скрининге препаратов для ионных каналов.
- Практическая ценность: обеспечивает стандартизацию, воспроизводимость и получение кинетических данных в реальном времени, которые недоступны при использовании конечного анализа.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») за счет ранней функциональной валидации, снижая риск неудач на поздних этапах из-за отсутствия взаимодействия с мишенью.
- Влияние на портфель: облегчает приоритезацию соединений с подтвержденной активностью GIRK с учетом рисков для дальнейшего перехода к этапу оптимизации ведущих соединений.
Рекомендации по внедрению
- Требуется опыт работы с культурами клеток (клетки AT T20), навыками работы с флуоресцентными красителями и эксплуатации кинетического планшетного ридера.
- Зависимость от наличия флуоресцентного планшетного ридера с функцией инжекции (например, Synergy 2) и совместимыми настройками возбуждения/эмиссии (520 nm/560 nm).
- Необходима стандартизация загрузки красителя, времени инкубации и условий буфера во всех лунках и планшетах.
- Адаптация метода для других клеточных линий требует проверки экспрессии GIRK и эффективности загрузки красителя.
- Практическое ограничение: специфичность анализа должна быть подтверждена с использованием ортогональных ингибиторов (например, Ba2+, Terapin Q), чтобы исключить изменения флуоресценции, не опосредованные GIRK.
