Подготовка мышиных эмбриональных фибробластов подходит для культивирования эмбриональных и индуцированных плюрипотентных стволовых клетках

Общая цель данной процедуры — подготовить эмбриональные фибробласты мыши, подходящие для культивирования человеческих эмбриональных стволовых клеток и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Это достигается путем предварительного разделения эмбрионов и удаления головы и органов, имеющих красный цвет. Затем ткань окончательно измельчают и подвергают перевариванию.

Затем клетки высевают, по три-четыре эмбриона на колбу, и подвергают экспансии. В завершение инактивированные митохондрии используют для приготовления кондиционированной среды. В итоге метод e LSA применяется для определения оптимальной концентрации активного вещества в кондиционированной среде, поддерживающей недифференцированный рост плюрипотентных стволовых клеток.

Как правило, люди, впервые применяющие данный метод, сталкиваются с трудностями, так как процедура требует стандартизации для получения высококачественных эмбриональных фибробластов мыши, которые обеспечат недифференцированный рост как эмбриональных стволовых клеток человека, так и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку этапы изоляции и диссекции эмбриона сложно освоить, так как работа с эмбрионом мыши требует определенных мануальных навыков. Процедуру продемонстрируют д-р Justina Suk, постдок в моей лаборатории, и аспирантка Caterina Dres.

После того как беременная мышь была пожертвована на 13-й или 14-й день после спаривания и рога матки были выделены, их следует коротко промыть в 70% ethanol и, соблюдая асептические условия в ламинарном шкафу для культивирования тканей, поместить в пробирку Falcon с PBS. Перенесите рога матки в чашку Петри и отделите каждый эмбрион от плаценты и эмбрионального пузыря. Удалите голову и органы красной системы, промойте оставшиеся части эмбриона в PBS и с помощью стерильного лезвия поместите их в чистую чашку Петри.

Наконец, измельчите ткань до тех пор, пока ее станет возможно набирать пипеткой. Затем добавьте один миллилитр 0,05% трипсина в EDTA и 100 K единиц DNase на один эмбрион. После этого перенесите ткань в пробирку Falcon объемом 50 миллилитров и инкубируйте ее в течение 15 минут при 37 °C.

Каждые пять минут инкубации диссоциируйте клетки путем тщательного пипетирования. Инактивируйте трипсин, добавив примерно один объем свежеприготовленной meth.Medium. Центрифугируйте клетки в течение пяти минут на низкой скорости.

Осторожно удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в теплом среде METH, подготовьте флаконы с 0,2% желатиновым покрытием и инкубируйте их в течение не менее двух часов. При комнатной температуре перенесите клетки из примерно трех-четырех эмбрионов в каждый флакон с 0,2% желатиновым покрытием. Фибробласты являются единственными клетками, способными прикрепляться к флаконам с желатиновым покрытием.

Примерно через 24 часа, когда клетки достигнут 80–90% конфлюэнтности, часть клеток следует заморозить при -80 °C. Оставшиеся клетки для дальнейшего использования экспандируют до пассажа P3 или P4. Для подготовки фидерных клеток с использованием культур P3–P4 сначала покройте флаконы T150 0,2% раствором желатина и инкубируйте при комнатной температуре не менее двух часов.

Разведите митомицин С в PBS и профильтруйте через шприцевой фильтр. Оспирируйте среду из матов и промойте их PBS без кальция или магния. Нанесите на маты 20 миллилитров среды, содержащей 10 микрограмм на миллилитр митомицина С, и инкубируйте в течение двух часов при 37 градусах Цельсия.

Затем дважды промойте клетки PBS и обработайте их трипсином. После инкубации суспендируйте клетки в среде meth, затем центрифугируйте их и повторно суспендируйте в подогретой среде meth. Рассейте клетки с плотностью 56 000 клеток на квадратный сантиметр в T150 флаконы и инкубируйте их в течение ночи; на следующий день после посева приступайте к работе с клетками meth.

Замените культуральную среду на некондиционированную среду для HESC, дополненную свежим FGF2 в концентрации 4 нг/мл, и поместите в инкубатор при 37 °C. Через 24 часа соберите кондиционированную среду из флаконов и замените ее свежей средой для HESC. Храните собранную среду при -20 °C.

Повторяйте сбор в течение шести дней после шестого сбора. Объедините всю среду и профильтруйте её. Затем храните в аликвотах по 50 мл при температуре -80 °C.

Для измерения активного in a в кондиционированной среде доведите все образцы и реагенты до комнатной температуры. Разведите антитело к активному in a в PBS с 1% BSA и добавьте 100 microliters в лунки микропланшета. Инкубируйте в течение ночи при комнатной температуре в течение 24 часов.

Трижды промойте лунки раствором PBST. Затем заблокируйте лунки на один час при комнатной температуре. Тем временем подготовьте активную стандартную кривую, включающую семь разведений и холостую пробу, используя рабочий диапазон от 0.25 до 32 nanograms per milliliter.

Добавьте дубликаты стандартов и образцов в лунки и инкубируйте в течение двух часов при комнатной температуре. Промойте лунки трижды раствором PBST. Затем добавьте биотинилированные вторичные антитела и инкубируйте в течение двух часов при комнатной температуре.

Затем трижды промойте лунки раствором PBST и добавьте стрептавидин HRP. После перемешивания и добавления субстрата оберните стенки планшета для защиты от света и инкубируйте в течение 20 минут при комнатной температуре. Добавьте по 100 microliters стоп-реагента в каждую лунку и осторожно перемешайте.

Наконец, настройте микропланшетный ридер на 540 нм с коррекцией длины волны на 540 или 570 нм и определите оптическую плотность для каждой указанной лунки. Ниже представлена типичная морфология недифференцированных hESCs, культивируемых в присутствии фидерных клеток, в кондиционированной среде и в определенной среде. В данных примерах HI PSCs культивируются в присутствии фидерных клеток.

На этих изображениях представлена морфология митозов и инактивированных фидерных клеток, используемых для приготовления кондиционированной среды. Как правило, клетки должны достичь конфлюэнтности через 24 часа после изоляции, после чего они готовы к заморозке или экспансии. Однако в некоторых случаях получение конфлюэнтных культур может занять от двух до трех дней.

Кондиционированную среду следует готовить из клеток четвертого пассажа или ранее. Это крайне важно, поскольку первичные клетки могут быть расширены только на четыре или пять пассажей до наступления старения. Цитокин, активный в а, считается одним из наиболее критических факторов, секретируемых фидерными клетками для поддержания недифференцированного роста плюрипотентных клеток.

Измерение уровня активных веществ в кондиционированной среде, как показано здесь, представляет собой удобный количественный анализ для контроля качества метаболитов. После освоения методики выделение эмбриональных фибробластов мыши может быть выполнено за один-два часа при соблюдении всех правил. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости заблаговременного разведения животных, а также предварительной подготовки и автоклавирования всех инструментов.