Фенотипическая и функциональная характеристика эндотелиальных колониеобразующих клеток, полученных из человеческой пуповинной крови

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы объяснить, как получить эндотелиальные колониеобразующие клетки или ХФУ из пуповинной крови человека. Это достигается путем сначала осаждения мононуклеарных клеток из пуповинной крови, а затем клонирования и расширения колоний ХФУ Е. Вторым шагом является характеристика клеток in vitro с использованием нового метода анализа одиночных клеток на клональный пролиферативный потенциал.

Наконец, клетки характеризуют в анализе формирования сосудов in vivo путем производства и имплантации гелей, содержащих Е-ХФУ, у мышей с заносом. В конечном счете, образование in vivo кровеносных сосудов хозяина может быть оценено путем окрашивания h и e ECFC, содержащих клеточные имплантаты. Основное преимущество этих методик перед существующими заключается в том, что они позволяют исследовать пролиферативный потенциал эндотелиальных клеток на уровне одной клетки.

Применение этого метода может быть расширено в сторону поиска диагностических и терапевтических инструментов для таких заболеваний, как дикая артериальная болезнь или ЗПА, поскольку этот метод позволяет нам исследовать пролиферативный потенциал и генную способность эндотелиальных клеток пациента. Перед началом процедуры добавьте один миллилитр коллагена из крысиного хвоста, наберите по одному в каждую лунку шестилуночного планшета для культуры тканей, а затем инкубируйте планшет в течение ночи в день процедуры, аликвотируйте пуповинную кровь в 15 миллилитровых единицах в 50-миллилитровые конические центрифужные пробирки. Затем добавьте по 20 миллилитров PBS в каждую пробирку и пипеткой несколько раз подавайте смесь вверх и вниз.

Далее наберите в пипетку 15 миллилитров флаконного ПА, поместите кончик пипетки на дно пробирки с разбавленной кровью и аккуратно подложите центрифугу alpac в пробирки на 30 минут при 740 умноженных на G при комнатной температуре без настройки тормоза замедления. После разделения клеток с помощью трансферной пипетки удалите мутный слой мононуклеарных клеток низкой плотности, расположенный на границе между фиальным пиком и разбавленной плазмой. Собранные элементы дозировать в 50 миллилитровую коническую пробирку, содержащую 10 миллилитров Е GM двух сред, и гранулировать мононуклеарные элементы в течение 10 минут при 515-кратном G при комнатной температуре при высокой настройке тормоза замедления, тщательно отсадить и выбросить надосадочную жидкость.

Затем после промывки гранулированных элементов с помощью EGM two twice resus, суспензируйте их мононуклеарами в EGM two по 1,25 умножить на 10 до седьмой ячейки на миллилитр. Теперь внесите пипеткой четыре миллилитра суспензии мононуклеарных клеток в каждую лунку пластины, покрытой коллагеновой оболочкой, и инкубируйте клетки до тех пор, пока в первый день не образуются колонии. После инкубации медленно извлекайте отработанную среду из лунок с помощью пипетки, не нарушая слабо прилипшие клетки.

Затем аккуратно добавьте четыре миллилитра Е ГМ два в лунки и верните тарелку в инкубатор. Колонии обычно появляются между 5 и 14 днями за день до процедуры. В 50 микролитрах коллагена крысиного хвоста.

Введите по одному в каждую лунку 96-луночного планшета, как и раньше, и инкубируйте планшет в течение ночи в день процедуры. Начните с промывания камер, которые были пройдены всего два-три раза дважды, с помощью PBS. После аспирации окончательной промывки PBS поместите стерильный цилиндр для клонирования, покрытый гелем, вокруг каждой колонии, плотно прижимая каждый цилиндр к пластине с помощью стерильных щипцов.

Добавьте две-три капли теплого тройного Е экспресса в каждый цилиндр для клонирования и инкубируйте цилиндры в течение трех-пяти минут, пока клетки не начнут отделяться. После того, как клетки начали отделяться, примерно на 250 микролитров EGM две среды в центр цилиндра и пипетки вверх и вниз для создания суспензии одиночных клеток. Теперь перенесите суспензию одиночных клеток из каждого цилиндра для клонирования отдельно в отдельную микроцентрифужную пробирку.

Инфицируйте клетки в шестилуночном планшете лентивирусами, экспрессирующими EGFP, и соберите клетки, экспрессирующие EGFP, с помощью флуоресцентной цитометрии. Затем инкубируйте FP-положительные клетки ЭЭГ и две EGM в пластинах, покрытых коллагеновой оболочкой. Когда Е ХФУ будут готовы, соберите их с помощью трипа Е экспресс, как только что было продемонстрировано, и ресуспендируйте клетки и э ГМ две среды до конечной концентрации примерно от 10 до 6 клеток на миллилитр.

Затем с помощью проточного сортировщика с низкой скоростью потока 20 клеток в секунду отсортируйте один EGP-положительный ECFC на лунку в предварительно подготовленную 96-луночную пластину, покрытую коллагеном, отрегулируйте конечный объем каждой лунки с помощью EGM от двух до примерно 200 микролитров на лунку. Затем используйте инвертированный флуоресцентный микроскоп, чтобы убедиться, что каждая лунка содержит только одну клетку. Инкубируйте планшет в течение двух недель с двумя сменами среды на 14-й день культивирования.

Промойте каждую лунку 100 микролитрами PBS перед фиксацией клеток 100 микролитрами 4%-ного параформного альдегида в течение 30 минут. Для ХФУ, которые не экспрессируют EGFP, добавляют реагент цита, зеленый флуоресцентный ядерный краситель после фиксации параформальдегида и инкубируют при четырех градусах Цельсия в течение ночи. Используйте флуоресцентный микроскоп для визуального количественного определения количества расширенных эндотелиальных клеток, как показано здесь: лунки с числом эндотелиальных клеток от 2 до 50 считаются кластерами эндотелиальных клеток.

Лунки с 51-2000 клетками относятся к ХФУ с низким пролиферативным потенциалом, а скважины с 2001 и более клетками относятся к ХФУ с высоким пролиферативным потенциалом. После отделения клеток с тройным Е экспрессом, как и раньше, получают жизнеспособное количество клеток клеточной культуры с помощью гемо, цитометра и трианового синего. Перелейте 2,4 миллиона жизнеспособных клеток в коническую пробирку объемом 50 миллилитров, а затем гранулируйте клетки центрифугированием, пока клетки вращаются.

Тщательно перемешайте компоненты для гелевой матрицы, а затем отрегулируйте pH до 7,4 с гидроксидом натрия, удерживая раствор на льду. После выброса надосадочной жидкости повторно суспендируйте гранулу в 360 микролитрах теплого е GM два. Затем добавьте 840 микролитров раствора гелевой матрицы к клеткам и тщательно перемешайте раствор до тех пор, пока клетки полностью не будут суспендированы в геле. Перенесите эту суспензию геля на один миллилитр в одну лунку 12-луночного планшета для культуры тканей и инкубируйте пластину до тех пор, пока гель не полимеризуется.

Затем перед инкубацией в течение ночи аккуратно накройте гель двумя миллилитрами теплого EGM два на следующий день и непосредственно перед имплантацией. С помощью ножниц для ирисов рассеките гель на две равные части и верните кусочки геля в ту же культурную лунку, содержащую две среды. После подтверждения седации с помощью щипкового пальца ноги побрейте нижнюю часть живота пяти-шестинедельного ребенка под наркозом, задержите мышь и тщательно очистите место операции, вращая спиртовые и бетадиновые подушечки.

Затем с помощью стерильных ножниц с острыми радужной оболочкой глаза сделайте примерно пятимиллиметровый разрез в нижнем квадранте живота, обнажая подкожное пространство между кожей и мышцами живота. Тупой. Рассеките дермальный слой от мышц живота в двух разных областях живота, чтобы создать карманы шириной от 15 до 20 миллиметров, один из которых ведет в верхнюю часть брюшной полости, а другой в другую область живота. Затем приподнимая дермальный слой, просто прилегайте к разрезу.

Вставьте одну половинку геля в один брюшной карман, в другую половину геля – в другой брюшной карман. После того, как гели были введены, закройте каждый разрез двумя-тремя стежками с помощью пяти полипропиленовых швов на режущей игле. Пометьте карты клеток и проведите послеоперационный мониторинг и обезболивание в соответствии с требованиями учреждения и протокола.

После того, как животное было принесено в жертву на 14-й день имплантации, промокните брюшную полость мыши спиртовыми салфетками и разрежьте кожу до первоначальной линии разреза. Затем иссекающие лоскуты кожи нянчились с вероятным расположением гелей. Разрезает по окружности вокруг гелей, чтобы удалить каждый имплантат, а затем помещает удаленные имплантаты в цинковый фиксатор.

Используя этот метод получения ECFC, мы наблюдали рост образования первичной колонии уже на пятый день. Обратите внимание на морфологию булыжника этих пяти культур ECFC, обозначенную наконечниками стрелок. Расширенные колонии экспрессируют эндотелиальные антигены, но не экспрессируют гемопоэтические антигены.

Как показано в данной репрезентативной фенотипической оценке эндотелиальных и гемопоэтических клеток in vitro, иммунофенотипирование показало, что e CFC экспрессируют эндотелиальные антигены, такие как CD 31, CD 34, CD 1 44, CD 1 46, FL one, flick one, flip four и NRP two, но не экспрессируют гемопоэтические антигены, CD 45 CD 14, CD 11 BC Kit CXCR four или CD 1 33. Важно отметить, что, как показано на этой гистограмме, расширенные колонии демонстрируют полную иерархию клонального пролиферативного потенциала на уровне одной клетки, которая варьируется от кластеров от двух до 50 клеток до колоний более 2001 года. Эти микрофотографии колоний, окрашенных цитом, зеленым флуоресцентным ядерным красителем, были получены после того, как полученные из пуповинной крови ХФУ Е были культивированы на уровне одной клетки в течение 14 дней.

Кроме того, ХФУ образуют гуманизированные кровеносные сосуды, которые перфузируются эритроцитами хозяина при имплантации иммунодефицитным мышам. При этом окрашивании полученным из пуповинной крови ECFC, содержащим имплантаты геля CELLULARIZE, можно наблюдать микрососуды, заполненные эритроцитами хозяина, которые образовались в коллагеновом геле фибронектина после 14 дней имплантации. Здесь античеловеческое окрашивание CD 31 в коричневый цвет еще раз подтверждает человеческое происхождение этих сосудов.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как получить ХФУ из пуповинной крови человека, а также о том, как клонировать, расширить и охарактеризовать функциональность колоний ХФУ после их развития. Этот метод проложил путь исследователям в области сосудистых эндотелий к изучению клонального пролиферативного потенциала эндотелия и генной способности эндотелиальных клеток, полученных из нескольких источников.