Мультимодальные изображений имплантации стволовых клеток в центральной нервной системе мышей

Общая цель этой процедуры заключается в достижении стандартизированного последующего наблюдения за поведением in vivo стволовых клеток, трансплантированных в мозг мыши. Это достигается путем предварительного мечения стромальных клеток, полученных из костного мозга, которые совместно экспрессируют EGFP и люциферазу с флуоресцентными микронными частицами оксида железа. Вторым шагом является надлежащая инъекция меченых MPIO BMC в ткань мозга мыши.

Затем неинвазивно отслеживают выживаемость и локализацию клеточных трансплантатов с помощью биолюминесцентной томографии и магнитно-резонансной томографии. Последним шагом является валидация результатов визуализации in vivo с помощью посмертного гистологического анализа. Этот метод может дать представление о поведении стволовых клеток после трансплантации в мозг мыши, но он также может быть применен к другим системам, таким как модельные организмы и исследования заболеваний.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку этапы работы с животными трудно освоить, потому что внутривенные и внутримозговые инъекции сложны в выполнении и сопряжены с определенными рисками для выживания животных. Чтобы начать эту процедуру, добавьте 75 раз по 10 к шести частицам оксида железа размером с ледниковый синий микрон в субсливающуюся растущую клеточную культуру. Инкубируйте их еще 16 часов, чтобы дать возможность частицам впитаться через эндоцитоз, затем смойте оставшиеся частицы.

Дайте клеткам расти еще 24 часа, чтобы получить беглость клеток и равномерное распределение G-B-M-P-I-O. После этого используйте флуоресцентную микроскопию для визуальной проверки поглощения частиц путем расчета отношения EGFP-положительных и G-B-M-P-I-O положительных клеток к общему количеству EGFP-положительных клеток. Далее промойте G-B-M-P-I-O, меченные BMSC люциферазой EGFP клетки дважды 10 миллилитров.

PBS обрабатывает клетки трипсином ЭДТА и затем собирает их. Затем Reward промойте клетки и повторно суспендируйте их в конечной концентрации 133 умножить на 10 до 6 клеток на миллилитр PBS. Наконец, держите клетки на льду до трансплантации.

При этой процедуре обезболивают мышь путем внутрибрюшинного введения смеси кетамина в дозе 80 миллиграммов на килограмм и ксилазина в дозе 16 миллиграммов на килограмм. Подождите пять минут, пока мышь уснет, затем побрейте ее голову, чтобы дать возможность провести стерильные манипуляции. Далее поместите мышку в стереотаксическую рамку, продезинфицируйте кожу спиртом.

После этого нанесите мазь на глаза, чтобы предотвратить обезвоживание. Сделайте разрез по средней линии кожи головы, чтобы обнажить череп и нацелиться на гиппокамп. Просверлите отверстие в черепе на два миллиметра сзади и два миллиметра сбоку с помощью бормашины.

На этом этапе кратковременно вдохните клеточную суспензию, затем аспирируйте клеточную суспензию в шприце. Затем опустите игольчатый шприц на глубину 2,5 миллиметра под твердую мозговую оболочку и дайте уравновесить давление в течение одной минуты. Через минуту втяните иглу в положение на два миллиметра под твердой мозговой оболочкой.

Затем вводят три микролитра клеточной суспензии с помощью автоматизированного микроинъекционного насоса со скоростью 0,70 микролитра в минуту. После инъекции подождите еще пять минут, чтобы предотвратить обратный ток введенной клеточной суспензии. Далее медленно втяните иглу.

После этого продезинфицируйте края кожи, затем зашите кожу. Введите 300 микролитров 0,9%-ного раствора натрия хлорида подкожно, чтобы предотвратить обезвоживание. В конце поместите мышь под нагревательную лампу, чтобы обеспечить восстановление после анестезии и провести биолюминесцентную визуализацию.

Обезболите мышь смесью 3%-ного изо, фтора и кислорода. Затем поместите мышь в фотонный формирователь изображений. Уменьшите уровень анестезии, отрегулировав уровень изофтора до 1,5%Затем введите внутривенно Люцифер в дозе 150 мг на килограмм массы тела.

Получайте изображение в течение пяти минут с помощью программного обеспечения для фотозрения. После этого выполните обработку изображений с помощью программного обеспечения M three vision и количественно оцените наблюдаемый сигнал с использованием фиксированных областей интереса. Для проведения магнитно-резонансной томографии необходимо обезболить мышь фтором 3% ISO в смеси кислорода и оксида азота.

Затем поместите мышь в ограничитель горизонтальной МРТ-системы на 9,4 Тесла. Уменьшите уровень анестезии, отрегулировав изофтор до 1%, затем нанесите мазь на глаза мыши, чтобы предотвратить обезвоживание. После этого с помощью ректального зонда следует следить за температурой тела.

Затем поместите датчик под брюхо мыши, чтобы контролировать частоту дыхания. Поддерживайте частоту дыхания на уровне 110 плюс-минус 10 раз в минуту, а температуру тела поддерживайте постоянной в узком диапазоне 37 плюс-минус 0,5 градуса по Цельсию. Затем поместите поверхностную радиочастотную катушку на верхнюю часть головки мыши.

Расположите мышь в центре магнита. Далее откройте ParaVision 5.1 Установите параметры последовательности в соответствии с прилагаемой рукописью. Затем получите набор из 10 корональных Т-двух взвешенных спиновых эхо-изображений с целью получения конкретной анатомической информации.

NT двухзвездочно-взвешенные градиентные эхо-изображения для изучения миграции стволовых клеток с простым разрешением 70 микрометров в квадрате. На этом этапе пожертвуйте мышью и удалите мозг. Зафиксируйте мозговую ткань при комнатной температуре в 4%-ном паральдегиде в PBS в течение двух часов.

Через два часа. Обезвоживайте мозговую ткань, помещая ее в различные градиенты сахарозы при четырех градусах Цельсия. На следующий день заморозьте мозговую ткань с помощью жидкого азота и храните ткань при температуре минус 80 градусов Цельсия до разрезания, когда она будет готова.

Разрежьте ткань мозга на участки толщиной 10 микрометров с помощью криостата. После этого под флуоресцентным микроскопом просматривают неокрашенные криопролеты на синюю флуоресценцию от частиц G-B-M-P-I-O и зеленую флуоресценцию от экспрессирующих EGFP клеток. Затем просмотрите неокрашенные криоучастки на зелено-красный фон флуоресценции воспалительных клеток.

Описанная процедура мечения MPIO ледникового синего цвета приводит к высокоэффективному мечению клеток BMSC, люциферазы EGFP, что может быть легко валидировано с помощью флуоресцентной микроскопии. Затем, после трансплантации G-B-M-P-I-O, меченых BMSC, люциферазных клеток EGFP в ЦНС мышей, выживаемость клеточного трансплантата может контролироваться с помощью биолюминесцентной визуализации in vivo на основе активности люциферазы. Кроме того, точную локализацию привитых клеток можно контролировать с помощью магнитно-резонансной томографии in vivo, основанной на содержании железа в ледяном синем MPIO.

Наконец, гистологический анализ показывает достоверность результатов, полученных с помощью биолюминесцентной томографии и магнитно-резонансной томографии. Стабильная выживаемость была подтверждена стабильной экспрессией EGFP во времени после его развития. Этот метод проложил путь исследователям в области молекулярной визуализации к изучению клеточных и молекулярных событий после трансплантации стволовых клеток в различных животных моделях нейродегенеративных заболеваний.

После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как проводить молекулярную визуализацию с применением биолюминесценции и магнитно-резонансной томографии, а также адекватно подтвердить результаты in vivo с помощью посмертной гистологической оценки.