Очистка и визуализация липополисахарида из грамотрицательных бактерий горячих водно-фенольной экстракции

Общая цель данной процедуры — экстракция ЛПС из грамотрицательных бактерий. Для этого сначала выращивают пятимиллилитровую ночную культуру бактерий в соответствующей среде и доводят оптическую плотность культуры до 0,5 при 600 нм. Затем бактерии осаждают путем микроцентрифугирования, после чего клетки ресуспендируют в Трис-буфере, содержащем SDS и beam или capto этанол.

Затем лизаты клеток кипятят и обрабатывают протеазой и нуклеазой. В завершение проводят две последовательные экстракции горячим водным фенолом и диэтиловым эфиром, при этом осторожно удаляют и сохраняют верхний водный слой синего цвета. В итоге можно получить результаты, демонстрирующие количество, а также наличие или отсутствие LPS и штаммов бактерий, а также модальность длины цепи O-антигена с помощью разделения методом SDS-PAGE и вестерн-блот-анализа со специфическими к LPS антителами или прямого окрашивания полисахаридов в геле.

Преимущество данного метода по сравнению с протеазной обработкой по Хитчкоку и Брауну заключается в том, что он позволяет получить чистые образцы LPS, которые лучше разделяются при помощи SDS-PAGE и вестерн-блоттинга. Этот метод позволяет изучить синтез и регуляцию липополисахаридов практически у любых грамотрицательных бактерий, включая E. coli и Salmonella, а также у биозащитных и новых патогенов, таких как Ella и Acetobacter соответственно. Для извлечения LPS подготовьте ночную культуру грамотрицательных бактерий в 5 мл среды LB с добавлением антибиотиков.

При необходимости культивируйте культуру в течение ночи в шейкере при 200 RPM и 37 °C. Используйте среду LB для разведения культуры в соотношении 1:10, после чего измерьте оптическую плотность при 600 нм. Приготовьте суспензию бактерий объемом 1,5 мл с конечной оптической плотностью при 600 нм, равной 0,5.

Осадите бактерии в микроцентрифуге при 10 600 ×g в течение 10 минут. Затем удалите и утилизируйте супернатант. Для экстракции LPS приготовьте следующие растворы: 1X SDS-буфер, 4% β-меркаптоэтанол или BME, 4% SDS и 20% глицерол в 0,1 M Tris-HCl pH 6.8 с добавлением щепотки бромфенолового синего, а также растворы ДНКазы I, РНКазы и протеиназы K в концентрации 10 mg/mL в стерильной дистиллированной воде; ресуспендируйте образец.

Осадок бактерий в 200 µL 1X SDS-буфера полностью ресуспендируют путем многократного пипетирования раствора. Вспененную суспензию бактерий медленно кипятят на водяной бане в течение 15 минут. Затем раствор охлаждают при комнатной температуре в течение 15 минут.

В качестве дополнительного этапа добавьте по 5 µL каждого из растворов ДНК 1 и РНК и инкубируйте образцы при 37 °C в течение 30 минут. Добавьте 10 µL раствора протеина K и инкубируйте образцы при 59 °C в течение трех часов. Затем к каждому образцу добавьте 200 µL ледяного насыщенного фенола в ТРИС-буфере.

Плотно закройте крышки и перемешайте содержимое каждой пробирки на вортексе в течение 5–10 секунд. Инкубируйте образцы при 65 °C в течение 15 минут. Периодически перемешивая на вортексе, охладите их до комнатной температуры.

Затем, работая в вытяжном шкафу, добавьте по 1 mL этилового эфира комнатной температуры в каждый образец и перемешайте на вортексе от 5 до 10 секунд. Центрифугируйте образцы при 20 600 ×g в течение 10 минут, после чего осторожно извлеките их из центрифуги. Отберите нижний синий слой из каждого образца, избегая попадания верхнего прозрачного слоя.

Добавьте в каждую пробирку еще по 200 µL ледяного Tris и насыщенного фенола, затем повторите экстракцию. Добавьте 200 µL двухкратного буфера SDS. Нанесите от 5 до 15 µL каждого образца LPS на 8–15% SDS-полиакриламидные гели.

Здесь представлен электрофорез в 12% SDS-ПААГ образцов ЛПС, полученных из различных штаммов bur cold area de losa, выделенных из мокроты пациентов с муковисцидозом. Различия в характере полос отражают разное количество повторяющихся единиц О-антигена, присоединенных к основным олигосахаридам. Схожее количество повторяющихся единиц наблюдается в образцах один и шесть.

Не забывайте, что работа с фенол-хлороформом может быть опасной, поэтому необходимо соблюдать меры предосторожности, такие как использование средств индивидуальной защиты (лабораторного халата, перчаток и защитных очков), а данные эксперименты следует проводить в вытяжном шкафу. Важно выполнять экстракцию быстро, чтобы избежать потери образцов в процессе обработки. После завершения данной процедуры для визуализации родства между штаммами необходимо провести вестерн-блоттинг или использовать методы визуализации липополисахаридов, такие как окрашивание серебром или другие методы.