Очистка и визуализация липополисахарида из грамотрицательных бактерий горячих водно-фенольной экстракции

Общая цель этой процедуры заключается в извлечении ЛПС из грамотрицательных бактерий. Это достигается путем выращивания пятимиллилитровой культуры бактерий в течение ночи в соответствующей среде и настройки культуры до оптической плотности на уровне 600 нанометров 0,5. Затем бактерии гранулируют с помощью микроцентрифугирования, а клетки ресуспендируют в трис-буфере, содержащем SDS и лучевой или каптоэностом.

Затем клеточные лизаты кипятят и обрабатывают протеазой и нуклеазой. Наконец, проводятся две последовательные экстракции горячим водным фенолом и диловым эфиром, которые тщательно удаляют и сохраняют водный синий слой. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают количество, а также наличие или отсутствие ЛПС и штаммов бактерий, а также модальность цепи антигена О путем разделения по странице SDS и западных анализов крови со специфическими антителами к ЛПС или прямого окрашивания полисахаридов в геле.

Преимущество этого метода по сравнению с лечением протеазой по Хичкоку и Брауну заключается в том, что этот метод приводит к получению чистых образцов ЛПС, которые могут быть лучше разрешены с помощью SDS page и вестерн-блоттинга. Этот метод может дать представление о синтезе и регуляции липополисахарида в VIR практически в любых грамотрицательных бактериях, включая кишечную палочку и сальмонеллу, а также в биозащите и новых патогенах, таких как Ella и Acetobacter соответственно. Для экстракции ЛПС в течение ночи необходимо провести культивирование грамотрицательных бактерий в пяти миллилитрах ЛБ с добавлением антибиотиков.

При необходимости выращивайте культуру в течение ночи в встряхивающем инкубаторе при 200 оборотах в минуту и 37 градусах Цельсия. Используйте LB для разбавления культуры в соотношении от 1 до 10, а затем измерьте оптическую плотность на 600 нанометрах на основе результата. Приготовьте суспензию бактерий объемом 1,5 миллилитра с конечной оптической плотностью при 600 нанометрах 0,5.

Гранулируйте бактерии в микроцентрифуге при 10, 600 перегрузках в течение 10 минут. Затем удалите и выбросьте надосадочную жидкость. Для извлечения ЛПС готовят следующие растворы: один буфер XSDS, 4%бетта ме каптоэтанол или BME 4%SDS, и 20%глицерин в 0,1 моляре трис HCL pH 6,8 со щепоткой бромфенолового синего и 10 мг на миллилитр растворов ДНК 1 РНК и протеиназы К в стерильной дистиллированной воде ресуспенд.

Гранулированные бактерии в 200 микролитрах одного буфера XSDS обеспечивают полную ресуспендию гранулы путем дозирования раствора вверх и вниз. Медленно прокипятите взвешенные бактерии на водяной бане в течение 15 минут. Затем дайте раствору остыть при комнатной температуре в течение 15 минут.

В качестве дополнительного шага добавьте по пять микролитров каждого из растворов ДНК и РНК и инкубируйте образцы при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. Добавьте 10 микролитров раствора протеазы К и инкубируйте образцы при температуре 59 градусов Цельсия в течение трех часов. Рядом с каждым образцом добавьте 200 микролитров ледяного триса, насыщенного фенола.

Плотно закройте крышки и закрутите каждую трубку в течение пяти-10 секунд. Инкубируйте образцы при температуре 65 градусов Цельсия в течение 15 минут. Вортекся, периодически охлаждайте их до комнатной температуры.

Затем под вытяжной шкаф добавьте один миллилитр этилового эфира комнатной температуры к каждому образцу и поворачивайте в течение пяти-10 секунд. Центрифугируйте образцы при 20, 600 умноженных на G в течение 10 минут и осторожно выньте их из центрифуги. Извлеките нижний синий слой из каждого образца, избегая верхнего прозрачного слоя.

Добавьте еще 200 микролитров ледяного триса, насыщенного фенола, и повторите экстракцию в каждую пробирку. Добавьте 200 микролитров двух XSDS буферов. Отделите от пяти до 15 микролитров каждого образца ЛПС на 8-15% полиакриламидных гелях SDS.

Здесь представлен 12%-ный гель SDS образцов ЛПС, приготовленных из различных штаммов холодного района де лоса, выделенных из образцов мокроты пациентов с муковисцидозом. Различные полосы отражают различное количество О-антигена, повторяющихся звеньев, прикрепленных к основным олигосахаридам. Аналогичное количество повторяющихся блоков можно увидеть в образцах 1 и 6.

Не забывайте, что работа с фенолдатиловым эфиром может быть опасной в таких мерах предосторожности, как ношение защитных средств индивидуальной защиты, таких как лабораторный халат, перчатки и очки, и эти эксперименты следует проводить в вытяжном шкафу во время попытки этой процедуры. Важно быстро выполнить экстракцию, чтобы не потерять образцы во время обработки. После этой процедуры необходимо использовать западный иммуноблоттинг или методы визуализации липополисахарида с помощью STR серебра или другие методы, чтобы визуализировать родство между штаммами.