Выявление и изоляция Медленно делящихся клеток глиобластомы человека в использовании Carboxy Fluorescein сукцинимидил Эстер (CFSE)

В данном видеопротоколе продемонстрированы методы идентификации и изоляции медленно делящихся клеток глиобластомы человека с использованием карбоксифлуоресцеинового сукцинимидилэфира (CFSE). Сначала клетки опухоли глиобластомы выращивают с помощью метода нейросфер. Затем полученные сферы диссоциируют до состояния одиночных клеток и окрашивают CFSE.

Клетки, нагруженные CFSE, высевают повторно. В культуре нейросфер полученные сферы диссоциируют до состояния одиночных клеток и анализируют с помощью проточного цитометра. Медленно и быстро делящиеся клетки идентифицируют и сортируют на основе интенсивности флуоресценции в зависимости от количества клеточных делений.

Гетерогенность частот является важнейшей особенностью рака. Эта гетерогенность обеспечивает устойчивость опухоли и представляет собой серьезное препятствие на пути к разработке полностью эффективного лечения. Следовательно, крайне важно разрабатывать инструменты и методы анализа для изучения и понимания этой гетерогенности, которая определяется генетически, фенотипически и функционально.

В данном видеопротоколе мы описываем стандартный метод с использованием систем фильтрации и I-C-F-S-C. Эта методика позволяет идентифицировать и разделять с помощью проточной цитометрии отдельные субпопуляции внутри культуры клеток, производных от глиобластомы человека, обладающих различными функциональными характеристиками. Мы использовали этот метод для изоляции и характеристики опухолевой популяции клеток с низкой скоростью деления — функциональным свойством, которое, как было показано, связано с инициацией опухоли при глиомах. Культура сфер создается и поддерживается с использованием анализа нейросфер, который описан в отдельном видео по адресу, указанному на экране.

Когда диаметр сфер глиомы достигает 150–200 мкм, среду, содержащую сферы, переносят в стерильную пробирку для культур тканей соответствующего размера и центрифугируют при 800 об/мин или 110 G в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем супернатант удаляют, а осадок сфер ресуспендируют в 1 мл предварительно подогретого трипсина-ЭДТА и инкубируют в водяной бане при 37 °C от трех до пяти минут. После этого добавляют равный объем ингибитора трипсина, аккуратно перемешивая содержимое пипеткой вверх-вниз для диссоциации сфер.

Клетокую суспензию снова центрифугируют. Супернатант удаляют, и клетки ресуспендируют в 1 мл базовой среды для нейральных стволовых клеток. 10 µL суспензии одиночных клеток тщательно смешивают с 90 µL трипанового синего и проводят подсчет клеток. Для окрашивания используют 1 миллион клеток.

1 мл окрашивающего реагента готовят, добавляя 1 мкл 5 мМ красителя CFSE к 1 мл базовой среды для нейральных стволовых клеток, чтобы получить конечную концентрацию окрашивания 5 мкМ. Затем окрашивающий раствор тщательно перемешивают. После этого необходимое количество клеток переносят в отдельную пробирку, центрифугируют и удаляют супернатант.

Затем к осадку добавляют раствор красителя CFSE, осторожно перемешивают до достижения гомогенности и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 минут для завершения процесса окрашивания. К клеткам, нагруженным CFSE, добавляют от 5 до 10 объемов ледяной базовой среды для нейральных стволовых клеток и тщательно перемешивают. Затем суспензию клеток центрифугируют, а супернатант удаляют.

На данном этапе на дне пробирки должен появиться слой клеток с зеленым оттенком, что указывает на успешное окрашивание. Для удаления избытка красителя CFSE проводят два или три цикла промывки: осадок ресуспендируют в 1 mL базальной среды для нейральных стволовых клеток, центрифугируют и удаляют супернатант.

После третьей промывки клетки ресуспендируют в 1 мл базальной среды для нейральных стволовых клеток и проводят подсчет клеток, как описано ранее, для последующего посева. Полную среду для нейральных стволовых клеток дополняют EGF до конечной концентрации 20 нг/мл. Затем клетки из групп с нагрузкой CFSE и без неё добавляют в соответствующие пробирки до достижения конечной концентрации 50 000 клеток/мл.

Затем суспензии клеток тщательно перемешивают и высевают в стерильные флаконы для культивирования тканей. После этого флаконы маркируют. Контроль окрашивания CFSE можно осуществлять с помощью флуоресцентного микроскопа, после чего флаконы помещают в увлажненный инкубатор при 37 °C и 5% CO2 на срок от пяти до 10 дней.

Для проверки окрашивания CFSE с помощью проточной цитометрии 500 000 клеток из групп с нагрузкой CFSE и без нее (отрицательный контроль) переносят в отдельные пробирки для цитометра. Настройки проточного цитометра корректируют в соответствии с инструкциями руководства пользователя для соответствующих параметров. Сначала анализируют контрольные клетки без окрашивания, регистрируя события по свойствам прямого и бокового светорассеяния, после чего на гистограмме зависимости частоты клеток от интенсивности CFSE выделяют основную популяцию клеток (гейтирование) для подтверждения уровня интенсивности флуоресценции CFSE.

Затем клетки, нагруженные CFSE, анализируют с использованием тех же параметров, что и для контрольных клеток, что и показано на видео. CFSE-положительные клетки демонстрируют интенсивность флуоресценции, которая на несколько порядков выше, чем у контрольных клеток. Это происходит, когда сферы глиомы достигают среднего размера примерно 150–200 мкм в диаметре.

Сферы пассируют, и из групп с загрузкой CFSE и без нее готовят суспензию одиночных клеток, как описано ранее. Затем клетки ресуспендируют в соответствующем объеме стерильного 1× PBS и проводят подсчет клеток, чтобы исключить погибшие или поврежденные клетки. При сортировке методом проточной цитометрии добавляют пропидий иодид в концентрации 1 µL на мл клеточной суспензии для сбора медленно и быстро делящихся клеток.

Для сортировки подготавливают две стерильные пробирки для культура тканей объемом 15 мл, в каждую из которых добавляют по 1 мл полной среды для нейральных стволовых клеток. Затем клетки помещают на лед при транспортировке в лабораторию проточной цитометрии. Сначала в проточном цитометре анализируют суспензию клеток из контрольной группы (незагруженной).

События отображаются на графике зависимости прямого светорассеяния от бокового светорассеяния для исключения мертвых или поврежденных клеток. Затем клетки отображаются на графике зависимости бокового светорассеяния от реактивности к PI, и одна популяция живых клеток выделяется как популяция один. После этого из популяции один по характеристикам прямого и бокового светорассеяния выбирается гомогенная группа клеток, которая выделяется как популяция два. Затем популяция два отображается на гистограмме зависимости частоты клеток от интенсивности CFSE в логарифмическом масштабе с использованием тех же параметров и стратегии гейтирования.

Клетки, меченные CFSE, подвергают анализу на проточном цитометре. Затем нижние 85% клеток выделяют в гейт быстроделящихся, а верхние 5% — в гейт медленноделящихся клеток. Эти различные интересующие популяции клеток отбирают и сортируют в отдельные стерильные пробирки для культура тканей объемом 15 мл, содержащие 1 мл полной среды для нейральных стволовых клеток.

Порог скорости сортировки должен быть отрегулирован таким образом, чтобы он не превышал 2, 500 событий в секунду. После завершения сортировки клетки центрифугируют, супернатант удаляют, а осадок ресуспендируют в соответствующем объеме среды и проводят подсчет клеток. Затем клетки из различных отсортированных популяций высевают с плотностью 50, 000 клеток на мл.

В полной среде для нейральных стволовых клеток, дополненной EGF в концентрации 20 ng/mL, клетки инкубируют от 5 до 10 дней для выращивания сфер. Это пример клеток. Вскоре после окрашивания красителем CFSE все клетки демонстрируют интенсивную зеленую флуоресценцию при визуализации с помощью флуоресцентного микроскопа.

На данном изображении представлена репрезентативная сфера глиомы, полученная из клеток, нагруженных A-C-F-S-E, через шесть дней после посева. Обратите внимание, что некоторые клетки все еще имеют очень интенсивное окрашивание CFSE. Это пример гистограммы проточной цитометрии, демонстрирующей снижение интенсивности CFSE с течением времени.

Синим цветом обозначены клетки, недавно нагруженные CFSE, демонстрирующие интенсивность флуоресценции. Она на несколько порядков выше, чем у ненагруженных клеток, обозначенных красным. Зеленым цветом представлена интенсивность флуоресценции, которая снизилась в течение шести дней после нагрузки CFSE вследствие деления клеток.

На представленных изображениях показаны типичные сферы, выращенные через семь дней после изоляции популяций с высокой и низкой скоростью деления. Частота формирования сфер не различается между двумя группами, однако клетки, сохраняющие CFSC, растут медленнее, в результате чего образуются более мелкие сферы по сравнению с клетками, в которых CFSC разбавляются. Использование CFSC для идентификации и изоляции субпопуляций клеток на основе скорости их деления является отправной точкой для последующих экспериментов и дальнейшей характеристики.

В данном протоколе представлен пример идентификации медленно делящихся клеток в культуре, полученной из глиомы человека, однако этот метод может быть применен и к другим типам опухолевых клеток или к нераковым системам. Благодарим за просмотр; надеемся, что данный протокол окажется полезным для ваших исследований.