Использование незаписанные, замороженные ткани для изучения природных распространения Муцин

Общей целью данного эксперимента является сохранение естественного распределения гликозилирования, секретируемой слизи в образцах тканей. Это достигается путем предварительного встраивания в ткани оптимальной температуры резки, среды или ОКТ, чтобы свести к минимуму обработку тканей, а затем обеспечить обнаружение гликановых структур, муцина и слизи. Срезы инкубируют с антителами к лектинам и гистохимическими красителями.

Связывание лектина может быть дополнительно затруднено конкурентным ингибированием или ферментативным расщеплением эпитопов гликанов для подтверждения специфичности связывания лектина. В конечном счете, сохранение слизи и замороженных образцов тканей можно сравнить с сохранением слизи в образцах, залитых парафином, с помощью мистического химического анализа. Основные преимущества использования этой методики перед существующими методами, такими как встраивание ткани в парену и фиксация с помощью раствора для автомобильного шума, заключаются в том, что этот метод не требует использования специализированных фиксаторов и позволяет использовать замороженные ткани, которые могут уже существовать в лаборатории.

Для начала дайте замороженной ткани нагреться до минус 20 градусов по Цельсию, поместив ее в камеру криомикротома. Тем временем создайте замораживающую ванну, добавив два метилбутана в неглубокую коробку из пенополистирола, а затем добавив в коробку сухой лед. Затем добавьте ровно столько OCT, чтобы покрыть дно отслаивающейся от замораживающей формы, а затем поместите салфетку в форму.

Следите за тем, чтобы ткань лежала на дне формы в нужной ориентации. Накройте ткань большим количеством ОКТ, а затем поместите форму в морозильную ванну. Соединение OCT станет белым по мере замерзания ткани После замораживания снимите форму с замороженного блока и поместите блок в специальный пакет для заморозки.

Храните замороженные блоки при температуре минус 80 градусов Цельсия до использования перед разрезанием ткани. Поместите замороженные блоки интереса в камеру криомикротома примерно на 30 минут, чтобы они нагрелись до минус 20 градусов по Цельсию. Когда блоки тепла, вырежьте секцию толщиной от трех до пяти микрометров, а затем поместите положительно заряженное стеклянное стекло поверх секции.

Салфетка прилипнет к предметному стеклу после сушки тканей на воздухе в течение 30-60 минут. Зафиксируйте предметные стекла с 10% буферной формулой в течение 30 минут при комнатной температуре, а затем промойте предметные стекла три раза в PB PBS по 10 быстрых погружений в 250 миллилитров буфера, чтобы испачкать ткани с АУМ. Сначала промойте горки в воде, а затем выдерживайте в 3%-ной уксусной кислоте в течение трех минут.

Затем инкубируйте ткани с раствором синего цвета AUM Через 30 минут промойте стекла в проточной водопроводной воде в течение 10 минут, а затем промойте в деионизированной воде. Противозаправьте ядра ядерным быстрым красным в течение пяти минут, а затем трижды промойте предметные стекла в деионизированной воде. Теперь обезвоживайте и очистите предметные стекла путем инкубации в течение одной минуты в 95% этаноле, затем три быстрые замены в 100% этаноле, а затем три смены цитрусовых растворяются в течение двух минут каждая.

Наконец, установите на предметное стекло защитное стекло с резонансной средой, такой как Cyto Seal 60, чтобы окрашивать ткани периодическим кислотным сдвигом. Сначала промойте горки в воде, а затем выдерживайте со свежеприготовленной 1%-ной периодической кислотой в течение пяти минут. Теперь трижды промойте горки в воде.

Один раз опустите предметные стекла в воду Milli Q, а затем окрасьте ткани реагентом shiff. Через 15 минут промойте горки в проточной воде из-под крана еще на 10 минут, а затем опустите один раз в воду. Закрасьте ядра sgio метином в течение 30 секунд, а затем трижды промойте предметные стекла в деионизированной воде.

Наконец, инкубируйте предметные стекла в течение 30 секунд. В водопроводной воде Scot's bluing реагент промыть еще три раза в деионизированной воде, а затем после обезвоживания тканей, как только что показано для окрашивания в кальциевый синий. Смонтируйте предметные стекла с помощью покровного стекла для флуоресцентного детектирования эпитопов гликанов с помощью лектинов.

Сначала заблокируйте предметное стекло с помощью BSA в PBS на 10–30 минут. Затем заблокируйте эндогенный биотин, инкубируя предметное стекло в течение 15 минут с авадоном, затем промывку PBS, а затем 15-минутную инкубацию с 0,01% биотина после еще одной промывки PBS. Поместите предметное стекло в коробку для окрашивания слоями свежеприготовленной смеси желаемых лектинов поверх каждого участка ткани, а затем аккуратно накройте лектиновую смесь парфюмом.

Теперь инкубируйте предметное стекло в темноте через час. Аккуратно снимите парфюм и трижды промойте горку PBS. Затем наложите на предметное стекло стрептококк авид в конъюгированную SCI пять и снова инкубируйте его в темноте через 30 минут, трижды промойте слайды PBS, а затем закрасьте ядра лепти.

Наконец, установите затвор с помощью защитного стекла с использованием водной среды, такой как монтажная среда для векторного монтажа для контроля фермента sase. Начните с добавления воды на дно пустой коробки для чаевых, чтобы получилась влажная камера. Поместите предметные стекла отрицательного контроля лицевой стороной вверх на верхний лоток коробки для чаевых.

Нанесите на участки ткани слой от 150 до 200 микролитров раствора УЗИ, а затем накройте каждое предметное стекло покровным стеклом, избегая образования пузырьков воздуха. Закройте крышку коробки и инкубируйте коробку при температуре 37 градусов Цельсия через два с половиной часа. Промойте слайды три раза в PBS при комнатной температуре, чтобы удалить свободные сливовые кислоты.

Затем инкубируйте предметные стекла с SNA в течение часа при комнатной температуре для конкурентного торможения. Контролируйте аликвоту 200 мкл лектиновой смеси на два флакона эйнора. Затем добавьте 200 миллимоляров ингибитора жаклин Meli bios в один из флаконов, а в другой флакон добавьте гидролизат хитина ингибитора SWGA в соотношении 1:10.

Затем инкубируйте предметные стекла с ингибитором, содержащим смеси, в течение одного часа при комнатной температуре. В этой ткани первого рисунка срезы тминовой кишки мыши или курицы, замороженные в ОКТ или погруженные в парафин, окрашивались периодическим кислотным шиффом в розовый или кальциевым синим в синий. Сравнение образцов тканей, погруженных в парафин, с замороженными тканями, встроенными в криопротекторную среду ОКТ, выявило поразительные различия в сохранности и качестве окрашивания гликопротеинов муцина в замороженных тканях.

В дополнение к муцину в бокаловидных клетках также была видна выделяемая слизь, о чем свидетельствуют стрелки в тканях, залитых парафином. Окрашивание слизи ограничивалось клетками бока. На этом рисунке можно наблюдать значительную потерю муцина и тканей, инкубированных в цитрусовом растворе.

Серийные срезы замороженных образцов куриной кишки фиксировали в 10% буферном формине и поддерживали в гидратации, обезвоживали в этаноле путем последовательной инкубации в 70% 90% и 100% этаноле в течение 20 минут каждый или обезвоживали в этаноле и затем очищали цитрусовыми в течение одного часа. Только дегидратация этанола и дегидратация этанола в сочетании с цитрусовыми улучшают морфологию тканей. Кроме того, обезвоживание этанола само по себе не оказало существенного влияния на окрашивание в синий цвет.

Напротив, инкубация цитрусовых уменьшала и ограничивала синее окрашивание бокаловидных клеток в узоре, который был аналогичен тому, который наблюдался для тканей, залитых парафином, показанных на предыдущем рисунке. Квадратиками обозначены области большего увеличения на срезах ткани с аллиевым синим. В этой следующей серии изображений образцы подвздошной кишки курицы, замороженные в ОКТ или погруженные в парафин, а затем прощупанные с помощью Жаклин синего цвета, SWG зеленого цвета и SNA красного цвета, показаны в замороженных тканях.

Связывание Жаклин с олинк-гликанами выявило структуры, которые, по-видимому, сочились из бокаловидных клеток в просвет, на что указывают стрелки в разделе замороженной ткани ОКТ. Напротив, связывание Жаклин с залитыми парафином тканями было ограничено клетками бокала и границей ворсинок, обозначенной этими стрелками. Окрашивание SWGA бета один-четыре GL частично локализуется со связыванием лектина Жаклин как в замороженных, так и в залитых парафином тканях, как указано стрелками.

Напротив, лектин SNA, выделенный красным цветом и обозначенный стрелками, внутриклеточно связывается с альфа-двумя шестисцепленными сиаловыми кислотами и не локализуется совместно с жаклином, который имеет синий цвет и обозначен пунктирными стрелками на этом рисунке. Эпитопы слизиковых кислот отщепляли из образцов подвздошной кишки курицы путем переваривания участка ткани с помощью УЗИ или оставляли расщепленными с помощью инкубации и буфера из ацетата натрия, как показано здесь. В результате ультразвукового лечения было отменено окрашивание биотинилированным SNA, которое наблюдается в необработанной ткани, подтверждая специфичность связывания SNA с сиаловыми кислотами.

Специфичность лектина также может быть подтверждена добавлением конкурентного ингибитора, такого как mely bios для окрашивания по Жаклину или гидролизат хитина для окрашивания SWGA куриной подвздошной кишки. На этот раз также в присутствии специфических ингибиторов лектинов, mely bios или гидролизата хитина, окрашивание Жаклин ингибировалось mely bios, но не гидролизатом хитина. И наоборот, окрашивание SWGA ингибировалось гидролизатом хитина, но не mely bios.

Эта последняя серия изображений демонстрирует, что замороженные образцы тканей, которые обычно получают в клинике и в исследовательских лабораториях, могут быть дополнительно внедрены в ОКТ и использованы для изучения гликанов на муцине, гликопротеинах, гликолипидах и гликанах. Эти биопсии колоректального рака из тканей ворсинчатой карциномы и слизистой карциномы были заморожены в жидком азоте, погруженном в ОКТ, и успешно окрашены на различные указанные эпитопы муцина и гликанов. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как встраивать ткани в ОКТ и как анализировать гликозилирование слизи и тканей с помощью иммунохимических методов.