Использование незаписанные, замороженные ткани для изучения природных распространения Муцин

Общая цель следующего эксперимента заключается в сохранении естественного распределения гликозилирования секретируемой слизи в образцах тканей. Это достигается путем первоначального заливки тканей в среду для криостата (optimal cutting temperature medium или OCT) для минимизации обработки тканей с последующим обеспечением возможности детектирования гликановых структур, муцина и слизи. Срезы инкубируют с лектинами, антителами и гистохимическими красителями.

Специфичность связывания лектинов можно дополнительно проверить с помощью конкурентного ингибирования или ферментативного расщепления гликановых эпитопов. В конечном итоге, сохранность слизи в замороженных образцах тканей может быть сопоставлена с сохранностью слизи в образцах, залитых парафином, с помощью гистохимического анализа. Основными преимуществами использования данного метода по сравнению с существующими способами, такими как заливка тканей парафином и фиксация раствором Карнуа, являются отсутствие необходимости в использовании специализированных фиксаторов и возможность использования замороженных тканей, которые могут уже иметься в лаборатории.

Для начала поместите мгновенно замороженную ткань в камеру криомикротома, чтобы она нагрелась до -20 °C. Тем временем подготовьте замораживающую ванну, налив метилбутан в неглубокий пенопластовый контейнер и добавив в него сухой лед. Затем налейте в съемную форму для замораживания столько OCT, чтобы покрыть ее дно, и поместите ткань в форму.

Убедитесь, что ткань лежит на дне формы в нужном положении. Покройте ткань дополнительным слоем OCT, затем поместите форму в охлаждающую ванну. По мере замерзания ткани соединение OCT станет белым. После полного замерзания снимите форму с замороженного блока и поместите блок в маркированный пакет для заморозки.

Храните замороженные блоки при температуре минус 80 °C до начала секционирования ткани. Поместите нужные замороженные блоки в камеру криомикротома примерно на 30 минут, чтобы они достигли температуры минус 20 °C. Когда блоки прогреются, сделайте срез толщиной от 3 до 5 мкм, а затем наложите сверху на срез предметное стекло с положительным зарядом.

Ткань прикрепится к предметному стеклу после высушивания на воздухе в течение 30–60 минут. Зафиксируйте образцы на стеклах с помощью 10% буферизованного формалина в течение 30 минут при комнатной температуре, затем промойте стекла трижды в PB PBS, совершая по 10 быстрых погружений в 250 мл буфера. Для окрашивания тканей сначала используйте aum. Blue, промойте стекла в воде, а затем инкубируйте в 3% уксусной кислоте в течение трех минут.

Затем инкубируйте ткани в растворе AUM blue. Через 30 минут промойте стекла под проточной водопроводной водой в течение 10 минут, а затем ополосните деионизированной (DI) водой. Проведите докрашивание ядер с помощью ядерного быстрого красного (nuclear fast red) в течение пяти минут, после чего трижды промойте стекла в DI воде. Теперь проведите обезвоживание и просветление срезов, инкубируя их в течение одной минуты в 95% ethanol, затем трижды быстро заменив раствор на 100% ethanol и трижды заменив его на citrus resolve по две минуты каждый раз.

Наконец, закройте предметное стекло покровным стеклом, используя среду для закрепления, такую как Cyto Seal 60, для окрашивания тканей периодической кислотой (PAS-реакция). Сначала промойте стекла в воде, затем инкубируйте в свежеприготовленном 1% растворе периодической кислоты в течение пяти минут. После этого трижды промойте стекла в деионизированной воде.

Однократно погрузите предметные стекла в воду Milli Q, затем окрасьте ткани реагентом Шиффа. Через 15 минут промойте стекла под проточной водопроводной водой в течение еще 10 минут, после чего однократно погрузите их в деионизированную воду. Проведите контрастное окрашивание ядер гематоксилином в течение 30 секунд, затем трижды промойте стекла в деионизированной воде.

В завершение инкубируйте предметные стекла в течение 30 секунд. После обработки синящим реагентом на основе водопроводной воды по Скотту промойте образцы еще три раза в деионизированной воде, затем проведите дегидратацию тканей, как было показано ранее для окрашивания Calcium Blue. Заклейте стекла покровным стеклом для флуоресцентного детектирования гликановых эпитопов с использованием лектинов.

Сначала заблокируйте предметное стекло, используя BSA в PBS в течение 10–30 минут. Затем заблокируйте эндогенный биотин, инкубируя стекло в течение 15 минут с avadon, после чего промойте его PBS и проведите 15-минутную инкубацию с 0,01% biotin после еще одной промывки PBS. Поместите стекло в окрасочную коробку, нанесите свежеприготовленную смесь необходимых лектинов на каждый срез ткани, а затем осторожно закройте смесь лектинов парафильмом.

Теперь инкубируйте предметное стекло в темноте в течение одного часа. Осторожно удалите перфузионный раствор и трижды промойте стекло PBS. Затем нанесите на стекло стрептавидин в конъюгированном SCI five и снова инкубируйте в темноте в течение 30 минут, трижды промойте стекла PBS, а затем проведите контрастирование ядер с помощью DAPI.

Наконец, закройте предметное стекло покровным стеклом, используя водную среду, например, среду Vector Mount, для контроля фермента sase. Сначала налейте воду на дно пустого штатива для наконечников, чтобы создать влажную камеру. Поместите предметные стекла с отрицательным контролем лицевой стороной вверх на верхний лоток штатива для наконечников.

Нанесите 150–200 мкл раствора US на срезы ткани, затем накройте каждое стекло покровным стеклом, избегая образования пузырьков воздуха. Закройте крышку контейнера и инкубируйте его при 37 °C в течение двух с половиной часов. Трижды промойте стекла в PBS при комнатной температуре, чтобы удалить свободные слизевые кислоты.

Затем инкубируйте предметные стекла с SNA в течение одного часа при комнатной температуре для конкурентного ингибирования. В две пробирки типа «эппендорф» внесите по 200 µL контрольной аликвоты смеси лектинов. Затем в одну из пробирок добавьте 200 mM ингибитора Jacqueline Meli bios, а в другую — ингибитор SWGA (гидролизат хитина) в разведении 1:10.

Затем инкубируйте предметные стекла со смесями, содержащими ингибитор, в течение одного часа при комнатной температуре. На этом первом рисунке срезы тканей толстой кишки мыши или курицы, замороженные в OCT или залитые парафином, были окрашены шиффом с периодической кислотой в розовый цвет или calcium blue в синий цвет. Сравнение образцов тканей, залитых парафином, с замороженными тканями, залитыми криопротектором OCT, выявило разительные различия в сохранности и качестве окрашивания муциновых гликопротеинов в замороженных тканях.

Помимо муцина в бокаловидных клетках, на парафиновых срезах тканей также был виден секретируемый слизистый секрет, на что указывают стрелки. Окрашивание слизи было ограничено бокаловидными клетками. На данном рисунке наблюдается существенная потеря муцина в тканях, инкубированных в растворе цитрусовых.

Серийные срезы замороженных образцов подвздошной кишки курицы фиксировали в 10% буферном формалине и поддерживали в гидратированном состоянии, дегидратировали в этаноле путем последовательной инкубации в 70%, 90% и 100% этаноле по 20 минут в каждом или дегидратировали в этаноле с последующей просветлением в citrus all в течение одного часа. Только дегидратация этанолом, а также дегидратация этанолом с последующим просветлением в citrus all улучшали морфологию тканей. Дальнейшая дегидратация только этанолом не оказала существенного влияния на интенсивность синего окрашивания.

Напротив, при инкубации с цитрусом интенсивность синего окрашивания снизилась, и оно ограничилось бокаловидными клетками, что соответствовало картине, наблюдавшейся в парафиновых срезах тканей на предыдущем рисунке. Рамками выделены области большего увеличения в срезах тканей, окрашенных аллиумом в синий цвет. На следующей серии изображений представлены образцы подвздошной кишки курицы, замороженные в OCT или залитые парафином, с последующим зондированием Jacqueline (синий), SWG (зеленый) и SNA (красный) в замороженных тканях.

Связывание лектина Jacqueline с гликанами olink выявило структуры, которые, как показано стрелками на срезе ткани, замороженной в ОКТ, казалось, вытекали из бокаловидных клеток в просвет. Напротив, связывание Jacqueline в тканях, фиксированных в парафине, ограничивалось бокаловидными клетками и щеточкой ворсинок, на что указывают соответствующие стрелки. Окрашивание SWGA на β1,4-Gal частично совпадает по локализации со связыванием лектина Jacqueline как в замороженных, так и в парафинированных тканях, что показано стрелками.

Напротив, лектин SNA, отмеченный красным цветом и указанными наконечниками стрелок, связывается внутриклеточно с сиаловыми кислотами с α2,6-связью и не колокализуется с жаккулином, который окрашен в синий цвет и отмечен на данном рисунке пунктирными стрелками. Эпитопы сиаловых кислот в образцах подвздошной кишки курицы были удалены путем переваривания среза ткани с помощью нейраминидазы или сохранены путем инкубации в натрий-ацетатном буфере, как показано здесь. Обработка нейраминидазой устранила окрашивание биотинилированным SNA, которое наблюдается в необработанной ткани, что подтверждает специфичность связывания SNA с сиаловыми кислотами.

Специфичность лектинов также может быть подтверждена путем добавления конкурентного ингибитора, такого как мелибьоз для окрашивания Jacqueline или гидролизат хитина для окрашивания SWGA. Образцы подвздошной кишки курицы снова инкубировали со смесью Jacqueline и SWGA, но на этот раз в присутствии специфических ингибиторов лектинов — мелибьоза или гидролизата хитина. Окрашивание Jacqueline подавлялось мелибьозом, но не гидролизатом хитина. И наоборот, окрашивание SWGA подавлялось гидролизатом хитина, но не мелибьозом.

Эта заключительная серия изображений демонстрирует, что образцы тканей, подвергнутые мгновенной заморозке (стандартная процедура в клиниках и исследовательских лабораториях), могут быть далее залиты в OCT и использованы для изучения гликанов на муцинах, гликопротеинов, гликолипидов и гликанов. Эти биоптаты колоректального рака из тканей ворсинчатой и слизеобразующей карциномы были мгновенно заморожены в жидком азоте, залиты в OCT и успешно окрашены на различные указанные эпитопы муцина и гликанов. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как заливать ткани в OCT и как анализировать гликозилирование слизи и тканей с помощью иммунохимических методов.