Electroantennographic биопроб в качестве скринингового инструмента для летучих растения-хозяина

Общая цель данной процедуры заключается в быстром скрининге большого количества летучих веществ растений-хозяев на предмет потенциальной биологической активности. Это достигается путем первоначального сбора летучих веществ интересующих растений-хозяев и их анализа с помощью ГХ-МС. Затем проводится идентификация и подтверждение химических компонентов.

Третьим этапом является скрининг отдельных компонентов в достаточном количестве повторностей на наличие биоактивности с помощью электрографического анализа. Заключительным этапом является создание и оценка смесей активных компонентов. В конечном итоге полученные результаты позволяют выделить сокращенный ряд компонентов или смесей, готовых для дальнейшего исследования в поведенческих тестах с интересующим видом насекомых.

Основным преимуществом данной методики по сравнению с существующими методами, такими как трудоемкие поведенческие исследования, является то, что экспресс-скрининг с помощью электрографического анализа значительно сокращает количество соединений, которые необходимо подвергнуть дальнейшим исследованиям для подтверждения процедуры. Является ли MR Wage техником моей лаборатории? После того как соответствующие летучие вещества будут идентифицированы с помощью газовой хроматографии и масс-спектрометрии, можно сначала провести электроантеннографический анализ или EAG каждого доступного летучего вещества.

Однако доступные летучие вещества необходимо подготовить. Приготовьте раствор каждого летучего вещества в пентане с концентрацией 5 mg/mL в контейнере с плотно закрывающейся крышкой и храните его при температуре 4 °C. Затем подготовьте пипетки для стимулов.

Маркируйте 10 пастельных дозаторов для каждого летучего вещества и оберните их наконечники небольшим кусочком парафильма. 10 дозаторов достаточно для доставки летучего вещества особям каждого пола при предварительном скрининге с небольшим количеством повторностей. Теперь выстройте оставшийся набор из пяти дозаторов в штативе и поместите биоаналитический диск в открытый конец каждого дозатора.

Аккуратно согните диск пинцетом и частично поместите его в широкий конец пипетки так, чтобы снаружи оставалось два-три миллиметра диска. С помощью дозатора или шприца нанесите 10 µL летучего раствора на каждый диск. Крайне важно правильно рассчитать, составить и подготовить растворы для обеспечения воспроизводимости результатов.

Подождите две минуты, а затем полностью вставьте диски в соответствующие пипетки. После загрузки немедленно загерметизируйте каждую пипетку с помощью param. Повторите подготовку пипеток для необходимого количества повторностей.

Используя тот же протокол, подготовьте отрицательный контроль, состоящий только из пентанов, и положительные контроли — в данном случае ацетофенон и половой гормон. Теперь приступайте к подготовке антенн насекомых.

В данном эксперименте предусилитель передает сигнал от вилочного электрода на прибор для регистрации электрогастрограммы (ЭГГ). Программное обеспечение, поставляемое с прибором ЭГГ, должно быть соответствующим образом настроено. Выполните настройку, установив частоту дискретизации на значение 106.7.

Переведите переключатель выпрямления (rectify) в положение «включено» и во вкладке фильтра (filter) установите диапазон фильтра от 0 до 42 hertz. Включите фильтр EAG и установите нижний порог отсечки на 0.1 hertz. Затем сохраните эти параметры в конфигурационный файл для последующего использования.

Работа с программой предельно проста: необходимо открыть файл нового проекта, сохранить его под определенным именем и приступить к записи. Нажатие на иконку в виде красного треугольника запускает процесс записи, которая продолжается в течение заданного интервала времени для каждого отдельного вдувания. После того как все вдувания для антенн будут выполнены, нажатие на иконку с черным крестом X останавливает запись, чтобы облегчить точный анализ ответов ЭАГ.

Небольшую линейку можно прикрепить скотчем к экрану компьютера на уровне базовой линии сигнала. Ответ записывается в миллиметрах, а затем пересчитывается в амплитуду в микровольтах. При необходимости записи можно воспроизвести для дальнейшего анализа.

В данном примере используются самцы и спаренные самки моли naval orange в возрасте от трех до четырех дней. Тем не менее, этот протокол может быть адаптирован для других насекомых. Перенесите каждое насекомое в небольшой пластиковый контейнер с крышкой.

В день анализа, непосредственно перед проведением биоанализа, поместите насекомое в широкое отверстие наконечника пипетки, который имеет более узкое отверстие, размер которого достаточен только для того, чтобы в него прошла голова насекомого. Затем с помощью другого, более узкого наконечника пипетки осторожно протолкните насекомое к узкому отверстию, пока его голова не станет видна под стереомикроскопом. Убедитесь, что антенны зафиксированы внутри удерживающей трубки, а основания антенн открыты для иссечения.

Затем расположите держатель вилки с тонким слоем электродного геля в непосредственной близости от антенны; с помощью микроножниц аккуратно отделите, а затем отсеките обе антенны и запустите таймер, чтобы зафиксировать время между этим событием и последующей стимуляцией. Используя инструмент с проволочным наконечником и небольшим количеством геля на конце, захватите одну антенну и поместите ее на вилку. Убедитесь, что основание антенны расположено на некрасном инертном заземляющем электроде вилки.

Повторите те же действия для второй антенны. Поместите основание антенны на ту же сторону вилки на расстоянии двух-трех миллиметров от первой установленной антенны. При необходимости подрежьте кончики антенны.

Нанесите электродный гель кистью, убедившись, что основание и кончик электрода погружены в гель и в нем нет пузырьков воздуха. Избегайте нанесения геля на центральную часть антенны, чтобы максимально увеличить площадь ее поверхности, подвергающейся воздействию порции летучих веществ. После того как гель правильно застынет, подключите вилку к предусилителю зонда.

Теперь направьте поток увлажненного воздуха на препарат для поддержания жизнеспособности препарата антенны. Через 10 минут после иссечения приступайте к подаче первых стимулов. Последовательность действий по стимуляции препарата начинается и заканчивается положительным контролем; между ними подается рандомизированная последовательность соединений без повторения одного и того же соединения дважды подряд и с включением как минимум одного отрицательного контроля; количество соединений, подаваемых на антенну, варьируется в зависимости от вида.

Препарат из моли морского апельсинового червя может оставаться активным более 30 минут, что позволяет легко проанализировать до 10 летучих соединений при небольшом количестве повторностей. Тот же принцип подачи образца применяется при последующем скрининге смесей соединений, которые вызвали ответ в ходе предварительного скрининга. Первую пипетку со стимулом необходимо подготовить за 30 секунд до подачи порции воздуха: распечатайте пипетку и установите ее в держатель таким образом, чтобы поток воздуха был направлен на расстояние двух-трех миллиметров от антенн через 10 минут после их иссечения.

Подайте первую порцию стимула в течение одной-двух секунд со скоростью 300 milliliters per minute. Затем быстро замените пипетку, чтобы вторая порция была подана ровно через одну минуту после первой. Соблюдение единообразия при обработке всех образцов позволит минимизировать вариативность фактически подаваемого количества летучих веществ.

После подачи последнего контрольного импульса положительного контроля извлеките антенну и очистите вилку. Протрите её салфеткой, смоченной в этаноле, и дайте полностью высохнуть перед следующим использованием. Для повышения пропускной способности анализов ассистент должен подготовить следующую антенну с чистыми вилками за 10 минут до завершения предыдущих манипуляций.

Для данного метода тестирования последовательностей требуется более одного разветвления. После каждого эксперимента эвтаназируйте подопытных мотыльков в среде с сухим льдом и препарируйте самок для проверки статуса спаривания. Предполагается, что совместно содержавшиеся самцы должны были спариться. Для подготовки антенн naval orange worm стимуляцию проводили короткими импульсами продолжительностью 2 s, а запись осуществлялась в течение 10 s с окном в 10 s при шкале 5 mV.

Типичным ответом было отклонение в отрицательную сторону. Тем не менее, регистрировались абсолютные значения. Все препараты из женских особей со слабым ответом на положительный контроль были отбракованы.

Средний ответ оставшихся препаратов составил 2 600 мкВ. Аналогично, средний ответ самцов на контроль pH пола обычно составлял 3000 мкВ. Таким образом, особи с недостаточным ответом были исключены; данные по антеннам, которые демонстрировали снижение отклика в ходе испытания, также были отбракованы.

Деградация считалась произошедшей, если отклик системы Anton на затяжку последнего положительного контроля составлял менее 75% отклика на первую затяжку контроля перед началом серии (pre-con control) или был меньше отклика на вторую затяжку контроля перед началом серии для остальных экспериментальных серий. Значения отклика анализировали, используя необработанные данные каждого измерения и вычитая из каждого значения отклик отрицательного контроля данной серии. Затем все положительные контроли в каждой серии усредняли и приводили к значению 1000 Microvolts, фиксируя коэффициент коррекции до 1000 microvolts для каждой серии.

Затем значения для исследуемых соединений были умножены на коэффициент коррекции положительного контроля. Наконец, для оценки перспективности каждого соединения для дальнейшего изучения сравнивали средний скорректированный ответ каждого исследуемого соединения по всем сериям экспериментов. Не забывайте, что работа с химическими веществами может быть крайне опасной, поэтому всегда следует соблюдать надлежащие меры предосторожности.