Жидкая фаза Affinity Capture методом с использованием магнитных шариков по изучению белок-белковые взаимодействия: Полиовирус-нанотела Пример

В этом протоколе используется взаимодействие между полиовирусом и полиовирусом, распознавание нанотел для демонстрации простого количественного анализа аффинного захвата жидкой фазы. В основном магнитные шарики, покрытые кобальтом, используются для извлечения помеченных белков, а также любых взаимодействующих радиомеченых белков. Сначала смешайте помеченные и помеченные белки и инкубируйте при комнатной температуре.

Затем добавьте магнитные шарики, которые распознают метку, отделите связанную фракцию меченого белка от несвязанной с помощью магнитов. Затем измерьте сигнал меченого белка, обнаруженного в несвязанной фракции, и определите количество меченого белка, обнаруженного в несвязанной фракции. Результаты этого анализа сродства к жидкой фазе чрезвычайно полезны при анализе белков, чувствительных к подтверждению конверсии.

Этот анализ аффинного захвата жидкой фазы может дать представление о взаимодействии между полиовирусом, распознаванием нано-бои и различных антигенов полиовируса. Метод также может быть применен к другим белковым взаимодействиям при условии, что один белок может быть помечен, а другой может быть обнаружен. Впервые мы получили идентификатор для этого метода, когда заинтересовались исследованием взаимодействия между полиовирусом, распознаванием нанотел и различными антигенами полиовируса.

Поскольку полиовирус чувствителен к подтверждающей конверсии, при прикреплении к твердой поверхности использование e LSA ограничено. Поэтому следует отдавать предпочтение системам на основе жидкой фазы. Примером такой системы на основе жидкой фазы, часто используемой в исследованиях полиовируса, является микробелок.

Иммунопреципитация. Несмотря на то, что этот тест доказал свою применимость, для него требуется кристаллизованная структура обычного антитела, которая отсутствует в нанотелах. Эти нанотела, которые представляют собой интересные и очень стабильные однодоменные антитела, могут быть легко сконструированы с помощью различных текстов.

Широко используется. Он проявляет сродство к бивалентным ионам, таким как никель и кобальт, которые, в свою очередь, могут быть легко покрыты магнитными шариками. Поэтому мы разработали простой количественный анализ аффинного захвата на основе магнитных шариков, покрытых кобальтом.

Риз имеет запас магнитных шариков вихревым способом и переносит 10 микролитров для каждого образца в пробирку, гранулирует шарики с помощью магнита. Снимите прозрачный супинат, чтобы промыть бусины. Добавьте 150 микролитров связующего буфера.

Соберите бусины с помощью магнита и удалите супинат после второй стирки. Повторно суспендируйте шарики в 40 микролитрах связующего буфера для каждого образца для контроля. Для фона в первом образце готовят лунку без радиоактивно меченного вируса, но с равным объемом связывающего буфера для контроля.

Образец два со 100% радиоактивностью. Добавьте все компоненты в лунку, за исключением замены нанокорпуса связующим буфером. Теперь прибавьте ко всем образцам 2000 подсчетов в минуту меченого S 35 полиовируса седьмого типа первого типа в общем объеме 80 микролитров связывающего буфера.

Примите управление. Пример первый. Добавьте 10 микролитров нанорастворителя тела в каждый образец.

Хорошо перемешиваем в течение 10 секунд на шейкере и выдерживаем в течение одного часа комнатной температуры. Далее добавить 40 микролитров промытой магнитной суспензии шариков и выдерживать 10 минут при комнатной температуре при непрерывном встряхивании, гранулировать шарики магнитом и переложить очищенный натант SUP в пробирку для измерения радиоактивности каждого образца, переложить 50 микролитров супината в счетную колбу. Добавьте три миллилитра сцинтилляционной жидкости и считайте на этом утеплителе.

Счетчик вытяните использованные магнитные шарики в пробирку с помощью воды и центрифугируйте 500 раз G в течение двух минут. Выбросьте супинат и снова суспендируйте шарики в шести миллилитрах 0,5 молярного гидроксида натрия. Затем разложите суспензию на несколько пробирок и выдержите в ультразвуковой ванне в течение пяти минут.

После гранулирования шариков магнитом и удаления супината добавьте по одному миллилитру 2%-ного раствора SDS в каждую трубку, затем перемешайте путем вортексирования и фольги в течение пяти минут. Теперь собираем бусины. Добавьте по одному миллилитру 0,2 моляра ЭДТА pH семь в каждую пробирку и инкубируйте пробирки в ультразвуковой ванне в течение пяти минут.

Затем соберите бусины, промойте бусины одним миллилитром воды три раза с последующим добавлением одного миллилитра 10 миллимолярного раствора хлорида кобальта. Поместите трубки в шейкер на 10 минут. Приступайте к заготовке бусин на магните и суспендируйте в одном миллилитре связующего буфера.

Постирайте дважды по одному миллилитру 20%-ного этанола, окончательно ресуспендируйте бусины в их первоначальном объеме 20%этанола, чтобы получить регенерированные бусины в концентрации 40 мг на миллилитр. Откорректируйте фоновую радиоактивность с помощью установки управления. Образец один — как значение 0% радиоактивности, а контрольный образец два — как значение 100% радиоактивности.

Теперь для каждого образца рассчитайте процент радиоактивности в организме как меру общего осаждения радиоактивно меченного вируса нанотелом. В этом эксперименте оценивают аффинность PVSS 38 C и антитела, специфичного к полиовирусу, с использованием трех различных антигенов полиовируса: нативного антигена, нагретого антигена и 14 s субъединиц. Интересно, что радиоактивность в организме образцов, содержащих меченые радиоактивными 14 s субъединицами, снижается с увеличением концентраций нанотела PVSS 38 C. Это свидетельствует об увеличении количества субъединиц полиовируса 14 s, связанных с нанотелами P pvs, S 38 C и опосредованно с магнитными шариками.

Поскольку сродства pvs S 38 C к N-антигенной и H-антигенной форме полиовируса не наблюдается, нано-тельце оказывается специфичным для 14-й s-субъединицы полиовируса. Сродство нанотела к его антигенам, измеренное этим методом, специфично как и у неродственного нанотела. NB 1 не проявляет реактивности в отношении трех антигенных форм полиовируса.

Эта система обеспечивает высокую воспроизводимость, как показано на этой кривой реакции на дозу, созданной разными исследователями в разные дни. После освоения этой надежной жидкой фазы, анализ аффинного захвата может быть правильно выполнен в течение двух часов. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как использовать этот анализ аффинного захвата жидкой фазы, основанный на магнитных биениях, при изучении взаимодействия между различными белками, особенно когда нельзя использовать твердофазные системы.