Выявление редких геномных вариантов с помощью секвенирования Объединенные SPLINTER
23 июня 2012 г.
Объединенные секвенирования ДНК является быстрым и экономически эффективной стратегией для обнаружения редких вариантов, связанные с комплексными фенотипов в больших группах. Здесь мы опишем вычислительный анализ объединенных следующего поколения, последовательность из 32 связанных с раком генов с помощью пакета SPLINTER программного обеспечения. Этот метод является масштабируемым, и применимы к любой фенотип интерес.
Общая цель данной процедуры — идентификация генов в популяции индивидуумов с преобладанием редких функциональных вариаций. Это достигается путем первоначального объединения пула образцов ДНК данной популяции. Вторым этапом является создание и секвенирование библиотеки для секвенирования следующего поколения.
Затем следует выравнивание ридов по референсной последовательности и создание модели ошибок. Заключительным этапом является компьютерный анализ с использованием алгоритма splinter. В конечном итоге анализ splinter данных пулированного секвенирования следующего поколения (Next generation sequencing) используется для выявления генов в популяциях, характеризующихся преобладанием редких функциональных вариантов. Демонстрация процедуры.
Сегодня с нами будет Франческо Вилания, аспирант лаборатории моего наставника и нашего коллаборатора Роба Митры, а также Энрике Рамос, аспирант моей лаборатории. Основное преимущество данной методики перед существующими методами, такими как генотипирование отдельных особей, заключается в том, что она позволяет очень точно обнаруживать редкие варианты последовательностей в смешанной популяции молекул ДНК без необходимости в какой-либо предварительной информации. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области генетики и геномики, например, как определить частоту новых редких вариантов, вызывающих заболевания, в крупномасштабных когортных исследованиях.
Для достижения оптимальной точности в каждом эксперименте со сплайсерами необходимо использовать отрицательный и положительный контроли; подготовьте реакционную смесь для ПЦР, используя высокоточную ДНК-полимеразу PFU ultra high fidelity. В качестве отрицательного контроля используется продукт ПЦР любой последовательности ДНК, в которой заведомо отсутствует генетическая вариабельность, например, клонированный остов вектора.
В данном случае используется ампликон длиной 1 934 п.н. из вектора M 13 MP 18. В качестве положительного контроля может быть использован любой набор ранее валидированных вариантов последовательностей, присутствующих во всей популяции. Если такие данные отсутствуют, данной лабораторией был разработан искусственный положительный контроль, представляющий собой ПЦР-продукт длиной 331 п.н., полученный из смеси сконструированных последовательностей, клонированных в вектор PGMT easy, как указано в данной таблице.
Эти последовательности объединяют для имитации различных частот встречаемости минорных аллелей истинных вариантов в пуле пациентов. После ПЦР-амплификации образцов, описанной в письменном протоколе к данному видео, очистите каждый ПЦР-продукт от избытка праймеров с помощью колонок для быстрой очистки Kyogen Kayak или 96-луночных фильтрующих планшетов с вакуумным манифольдом для крупномасштабной очистки. После очистки количественно определите содержание каждого ПЦР-продукта с использованием стандартных методов.
Подготовьтесь к объединению всех ПЦР-продуктов и контролей в пул, нормализованный по количеству молекул. Объединение по концентрации приведет к избыточному представительству коротких ампликонов по сравнению с более длинными продуктами. Вместо этого объедините нормализованное количество молекул для каждого ампликона.
Выберите произвольные числа, достаточно большие для обеспечения точности при дозировании пипеткой. Возьмите ПЦР-продукты и контроли. Лигирование ПЦР-продуктов необходимо, так как фрагментация коротких ПЦР-ампликонов, скорее всего, приведет к смещению репрезентативности в сторону их концов.
По этой причине мы лигируем продукты ПЦР в большой вектор перед их фрагментацией. Подготовьте смесь для лигирования тупых концов, используя T4 лигазу, T4 ПНК и ПЭГ, как указано в протоколе. Инкубируйте реакционную смесь при 22 °C в течение 17 часов.
Затем инкубируйте смесь при 65 °C в течение 20 минут, после чего храните при 4 °C. Далее проверьте эффективность лигирования, нанеся 50 нг образца на агарозный гель. Успешное лигирование будет характеризоваться наличием полосы с высокой молекулярной массой в соответствующей лунке.
Подготовьте образец к фрагментации ДНК методом случайного соникации, разбавив его в 10 раз буфером Qiagen PB Buffer для снижения вязкости. Затем фрагментируйте крупные конкатемеры продуктов ПЦР с помощью прибора Diagen Node BioRuptor на 24 образца, проводя соникацию на высокой мощности в течение 25 минут с циклом 40 секунд работы и 20 секунд отдыха в каждой минуте. Проверьте результаты фрагментации ДНК с помощью агарозного геля и приступайте к секвенированию на платформе Illumina, как описано в тексте.
Для начала секвенирования выполните выравнивание чтений. Преобразуйте необработанные файлы чтений секвенирования в формат scarf или сжмите их. Сжатие является необязательным.
Это позволяет сэкономить время и пространство для последующих этапов анализа без потери любой значимой информации. С помощью прилагаемого инструмента выравнивания выполните выравнивание необработанных чтений по аннотированной ускоренной референсной последовательности. Специфические для целевых регионов данные включают реакции ПЦР, а также положительный и отрицательный контроли.
Входной формат должен быть в формате scarf или сжатым. Затем выполните тегирование файлов, как описано в тексте. Каждый запуск генерирует уникальный профиль ошибок секвенирования, который необходимо охарактеризовать для точного вызова вариантов с целью моделирования ошибок для каждого запуска.
В библиотеку каждого пула образцов из выровненного файла с тегами включен внутренний контроль с известной вариацией последовательности. С помощью прилагаемого инструмента создайте файл модели ошибок, используя референсную последовательность отрицательного контроля; можно использовать всю последовательность отрицательного контроля или ее часть, указав 5'- и 3'-концы. Всегда следует применять уникальные чтения и псевдоподсчеты.
Инструмент создаст три файла, имена которых будут соответствовать параметру выходного файла с окончанием 0, 1 или 2. Эти файлы соответствуют моделям ошибок нулевого, первого и второго порядка соответственно для вызова вариантов с помощью splinter. Для визуализации профиля частоты ошибок запуска следует всегда использовать модель ошибок второго порядка.
Скрипт Perl, используемый для построения графика модели ошибок, может быть применен для создания PDF-графика ошибок на основе файла модели ошибок нулевого порядка. Этот график выявит тенденции ошибок, специфичные для конкретного запуска, и может быть использован для определения максимального количества считываемых оснований для анализа. В следующем разделе будет продемонстрировано, как запустить программу splinter для выровненного файла с использованием модели ошибок для обнаружения редких вариантов последовательностей.
Первым этапом анализа является запуск программы splinter для выровненного файла с использованием референсной последовательности и модели ошибок. Одиночные основания ридов могут быть исключены из анализа, если они окажутся дефектными. Пороговое значение P-value определяет строгость анализа выявления вариантов.
Хорошим начальным значением является минимальный порог отсечения -1,301. Опция размера пула (pool size) оптимизирует дискриминацию сигнала от шума в алгоритме путем устранения потенциальной вариабельности при частоте минорных аллелей ниже, чем частота одного аллеля в фактическом пуле. Опцию размера пула следует установить на ближайшее значение, которое превышает фактическое количество аллелей, проанализированных в эксперименте.
Вариации, выявленные при низких частотах, будут игнорироваться как шум. После ввода всех параметров и имен файлов запустите splinter. Этот файл возвращает все статистически значимые попадания по всей выборке с описанием положения и типа варианта.
Значение P-value для частоты варианта на одну цепь ДНК и общее покрытие на одну цепь ДНК. Файл списка (list vial) используется программой splinter для нормализации покрытия по всему образцу. Первое поле указывает на интересующий ампликон, в то время как второе поле указывает позицию, в которой присутствует мутация.
N означает, что остальная часть последовательности не содержит никаких мутаций. Нормализация и анализ положительного контроля имеют ключевое значение для максимизации чувствительности и специфичности конкретного анализа. Это важно, поскольку, скорее всего, первоначального порогового значения -1,301 будет недостаточно для устранения всех ложноположительных результатов.
В каждом анализе сплинтеров будет указано фактическое значение P-value для каждого выявленного варианта, которое не могло быть предсказано заранее. Тем не менее, весь анализ можно повторить, используя наименее строгое значение P-value, отображаемое в первоначальном результате для известных истинно положительных базовых позиций. Это позволит сохранить все истинно положительные результаты, исключив при этом большинство, если не все, ложноположительные, которые обычно имеют гораздо менее значимые значения P-value по сравнению с истинно положительными.
Для автоматизации этого процесса можно использовать скрипт для определения порогового значения (cutoff tester script). Для работы этого скрипта требуется выходной файл Splinter и список положительных контрольных хитов в виде файла с разделителями-табуляторами, аналогичного тому, который используется для нормализации. В результате будет получен список пороговых значений, последовательно приводящих к оптимальному.
Последняя линия представляет собой наиболее оптимальный порог отсечения для данного запуска и, следовательно, может быть использована для анализа данных. Оптимальным результатом является достижение чувствительности и специфичности, равных единице. Однако, если это не удалось, анализ сплинтеров можно оптимизировать, изменив количество включенных считываемых оснований.
Окончательный порог отсечения можно применить к данным с помощью скрипта cutoff cut, который отфильтрует выходной файл splinter, удалив хиты с показателями ниже оптимального порога. На этом этапе будет создан итоговый выходной файл splinter, содержащий однонуклеотидные полиморфизмы (snips) и индели, присутствующие в образце. Пожалуйста, обратите внимание, что формат вывода для инсерций несколько отличается от формата для замен или делеций.
На графиках данного типа визуализируется точность в зависимости от покрытия для одного аллеля в объединенном образце. Точность оценивается как площадь под кривой (AUC) рабочей характеристики приемника и варьирует от случайной точности 0,5 до идеальной точности 1,0. В данном примере AUC представлена как функция покрытия на один аллель при выявлении одиночных мутантных аллелей в пулах из 200, 500 и 1000 аллелей.
Здесь график UC построен в зависимости от общего количества вставок, делеций и замен. На данном графике ошибок показана вероятность включения ошибочного основания в определенной позиции. Профиль ошибок демонстрирует низкий уровень ошибок с тенденцией к его повышению к 3'-концу секвенируемого рида.
Заметно, что разные референсные нуклеотиды характеризуются различными вероятностями ошибок. На данном графике показана точность программы splinter при оценке частоты аллелей для позиций, где покрытие на аллель превышало 25x. Представлено сравнение частот аллелей в пуле ДНК, оцененных с помощью splinter, с количеством аллелей, измеренным в ходе полногеномных поисков ассоциаций или GWAS.
При очень высокой корреляции была отобрана популяция из 974 человек, для которых было проведено секвенирование целевых участков длиной более 20 килобаз. Для обнаружения редких вариантов применялся метод Splinter. Согласно стандартному протоколу, для каждого индивидуума было предварительно выполнено генотипирование для проверки соответствия GWAS между генотипированием тегированных и новых вариантов.
Результаты анализа объединенного образца были отличными. Три варианта, два из которых были редко встречающимися в популяции, были определены как novo на основе данных секвенирования и подтверждены индивидуальным пиросеквенированием; частоты минорных аллелей или математическое соответствие между пиросеквенированием и секвенированием пула были на высоком уровне. После того как вы обнаружили редкий вариант в объединенном образце, часто возникает необходимость определить функциональные последствия выявленного варианта.
Таким образом, следующим этапом процесса после разработки становится аннотация ваших вариантов. Этот метод открыл исследователям в области секвенирования ДНК возможность быстро и экономично изучать редкие варианты для их характеристики в рамках популяционных исследований с большим количеством участников. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как выявлять редкие варианты последовательностей в пуле образцов ДНК с помощью системы splinter.
Обзор
Секвенирование объединенного пула ДНК представляет собой эффективный метод выявления редких генетических вариантов, связанных со сложными признаками в больших популяциях. В данной статье подробно описывается компьютерный анализ данных пулового секвенирования 32 генов, связанных с раком, с использованием программного пакета SPLINTER.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Генетика
- Геномика
- Исследования рака
Обзор
- Секвенирование объединенных образцов ДНК позволяет выявлять редкие функциональные вариации в популяции.
- Данный метод масштабируем и применим к различным фенотипам.
- Он представляет собой экономически эффективную альтернативу традиционному генотипированию отдельных особей.
- Метод использует технологии секвенирования следующего поколения.
Цель исследования
- Для идентификации генов с редкими функциональными вариантами в смешанных популяциях.
- Для демонстрации эффективности алгоритма SPLINTER при анализе данных пулового секвенирования.
- Для разработки протокола точного обнаружения вариантов в исследованиях больших когорт.
Используемые методы
- Объединение образцов ДНК из популяции.
- Создание и секвенирование библиотеки для секвенирования следующего поколения.
- Выравнивание прочтений секвенирования на референсную последовательность.
- Вычислительный анализ с использованием алгоритма SPLINTER.
Основные результаты
- Успешная идентификация редких вариантов последовательностей в объединенных образцах.
- Демонстрация способности алгоритма SPLINTER моделировать ошибки секвенирования.
- Валидация метода с использованием как положительного, так и отрицательного контролей.
- Создание моделей ошибок для точного определения вариантов.
Выводы
- Пулированное секвенирование ДНК является мощным инструментом для изучения генетической вариабельности.
- Программное обеспечение SPLINTER повышает точность выявления вариантов.
- Этот метод может внести значительный вклад в понимание сложных генетических признаков.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Выявление редких геномных вариантов в больших популяциях имеет решающее значение для валидации мишеней при исследовании сложных заболеваний, в которых распространенные варианты не объясняют фенотипическую вариабельность. Метод пул-секвенирования с использованием технологии SPLINTER представляет собой экономически эффективный и масштабируемый способ проверки терапевтических гипотез путем идентификации низкочастотных функциональных вариантов без предварительного знания о них. Это способствует снижению рисков на ранних этапах поиска за счет возможности оценки частоты аллелей и подтверждения вариантов в когортах пациентов с соответствующими заболеваниями, что напрямую влияет на приоритизацию портфеля разработок и последующие механистические исследования.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичное открытие и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем обнаружения редких функциональных вариантов в объединенных популяциях, что проясняет генетическую архитектуру заболеваний.
- Практическая ценность: снижает необходимость в индивидуальном генотипировании, уменьшая затраты и увеличивая пропускную способность при скрининге вариантов в больших когортах.
- Прогностическая ценность: обеспечивает количественное определение частоты аллелей и валидацию вариантов, повышая достоверность ассоциаций между мишенью и заболеванием.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать количественные данные о вариантах из объединенных данных, что обеспечивает стандартизированную оценку распространенности вариантов в геномных локусах.
- Практическая ценность: обеспечивает создание воспроизводимых моделей ошибок и контролей нормализации, что гарантирует стабильное детектирование вариантов в разных запусках секвенирования.
- Масштабируемость: совместимость с методами гибридизационного захвата и штрихкодирования позволяет адаптировать метод для различных типов образцов, включая ДНК опухолей.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная непрерывность: облегчает переход от обнаружения вариантов к функциональному анализу, предоставляя валидированные редкие варианты для фенотипического анализа.
- Снижение механистических рисков: позволяет сравнивать частоты вариантов между пораженными и здоровыми когортами, что способствует установлению причинно-следственных связей при сложных признаках.
- Релевантность доклинических моделей: позволяет выявлять варианты, подходящие для редактирования в модельных системах с целью оценки функционального воздействия и участия сигнальных путей.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум открытий — от формулирования гипотезы до идентификации ведущих соединений, обеспечивая результаты детектирования вариантов, которые позволяют определить выбор мишени и готовность анализа.
- Фундаментальная биология: способствует проверке гипотез путем выявления генов с обогащением редкими функциональными вариациями в когортах пациентов с заболеваниями.
- Скрининг: обеспечивает детектирование вариантов, готовых к анализу, благодаря стандартизированной подготовке библиотек и компьютерному анализу с использованием SPLINTER.
- Аналитика: позволяет создавать модели ошибок, определять пороговые значения P-value и оценивать частоту аллелей для количественного сравнения выявленных вариантов в различных условиях.
- Трансляционные исследования: обеспечивает связь с доклинической валидацией, предоставляя подтвержденные варианты для функциональной аннотации и тестирования в модельных системах.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемый конвейер пулового секвенирования и анализа, применимый к множеству мишеней и различных областей заболеваний.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность валидации мишени за счет сокращения количества ложноположительных результатов с помощью внутреннего контроля и итеративной оптимизации пороговых значений.
- Операционная ценность: стандартизирует подготовку библиотек, моделирование ошибок и поиск вариантов, что повышает воспроизводимость результатов в различных центрах и исследованиях.
- Стратегическая ценность: увеличивает эффективность использования капитала, позволяя проводить скрининг редких вариантов в больших когортах при снижении стоимости анализа одного образца.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритезацию мишеней с учетом рисков, предоставляя данные о частоте аллелей и подтверждение вариантов для принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go).
Особенности реализации
- Требуются навыки в области молекулярной биологии для подготовки объединенных библиотек и секвенирования следующего поколения.
- Процесс зависит от наличия оборудования для ПЦР, лигирования, фрагментации и секвенирования, а также от вычислительной инфраструктуры для запуска SPLINTER.
- Необходима межкомандная стандартизация разработки контролей, стратегий объединения и определения пороговых значений для получения воспроизводимых результатов.
- При адаптации метода следует учитывать корректировку размера ампликона, соотношения контролей и глубины объединения для различных геномных регионов и типов образцов.
- Практические ограничения включают необходимость обеспечения достаточного покрытия на каждый аллель и точного количественного определения исходных молекул для предотвращения ошибки амплификации.
