Быстрое удаление фибробластов с высокой плотностью эмбриональных стволовых клеток культур

Общая цель следующего эксперимента заключается в быстром и эффективном выделении колоний стволовых клеток человека. Это достигается путем культивирования эмбриональных клеток человека на плотном слое эмбриональных фибробластов мыши. Со временем экспансия популяции стволовых клеток увеличивает их количество, а также позволяет им формировать островковидные колонии в данной среде.

Затем слой метилурона удаляют путем аспирации, оставляя отдельные колонии эмбриональных стволовых клеток человека. Результаты иммуногистохимического окрашивания на маркеры стволовых клеток показывают, что данный метод изоляции эффективен для удаления фидерных клеток и сохранения целостности колоний. Идея этого метода возникла у меня во время совместного культивирования клеток в нашей лаборатории, когда я стремился спасти культуры стволовых клеток от чрезмерно плотного роста в системах культивирования.

Основная проблема, с которой сталкивается большинство пользователей данной системы, — это недостаток опыта в культивировании стволовых клеток человека. Мы обнаружили, что этот метод особенно полезен, когда необходимо изолировать большое количество эмбриональных стволовых клеток человека для проведения экспериментов. По сравнению с другими методами, такими как сортировка или ручной отбор колоний стволовых клеток, данный способ является более быстрым и эффективным для изоляции колоний из культур с высокой плотностью клеток.

Эмбриональные фибробласты мыши следует обработать митомицином С или подвергнуть облучению перед совместным культивированием с эмбриональными стволовыми клетками, чтобы предотвратить их деление. За два часа до высева МЭФ каждую 60-миллиметровую плазменно-обработанную культуральную чашку следует покрыть двумя миллилитрами 0,05% желатина. Разморозьте виалу с обработанными МЭФ, центрифугируйте в течение пяти минут при 1 500 об/мин и высейте культуру плотностью примерно 20 000 клеток на см² в чашку с желатиновым покрытием. Инкубируйте культуру в течение ночи до прикрепления клеток. Новые культуры можно создавать из криоконсервированных клеток или путем перепассирования текущих культур на чашки с покрытием из МЭФ. При использовании планшета с крупными колониями эмбриональных стволовых клеток человека однократно промойте их тремя миллилитрами подогретого фосфатно-солевого буфера.

Добавьте 3 мл раствора коллагеназы IV в концентрации 1 мг/мл и инкубируйте от 5 до 10 минут при 37 °C. Клетки не будут отделяться или скручиваться в шарики, как это происходит при использовании трипсина. С помощью края наконечника дозатора на 5 мл создайте сеточный рисунок на колониях, чтобы разбить их на небольшие клеточные агрегаты.

Теперь, удерживая кончик наконечника пипетки перпендикулярно планшету для культивирования, соскоблите дно планшета, чтобы отделить все клетки от поверхности. Перенесите клетки в пробирку типа «Falcon» для сбора, центрифугируйте при 1000 RPM в течение пяти минут и аспирируйте среду. Затем аспирируйте среду из культур эмбриональных фибробластов мыши, высеянных накануне.

Затем перенесите эмбриональные стволовые клетки человека на чашку в соотношении от одного к трем по отношению к исходной чашке и добавьте три миллилитра среды для эмбриональных стволовых клеток человека. Клетки hESC культивируют при высокой плотности в течение 10–14 дней. Поместите кончик аспирационной пипетки к краю чашки и с помощью всасывания осторожно приподнимите край листа матригеля.

Удалите среду из чашки. Дайте наконечнику захватить клеточный пласт, затем медленно переместите наконечник по дуге над планшетом. Если пласт в значительной степени засоряет пипетку, извлеките его из культуры.

Аккуратно постучите по верхней части чашки с культурой с помощью аспиратора, чтобы окончательно разрушить клеточные агрегаты, и полностью удалите клетки путем аспирации. Немедленно замените среду для культивирования эмбриональных стволовых клеток человека и поместите культуру обратно в инкубатор для клеточных культур после посева в чашки. Данная система кокультивирования позволяет получить колонии эмбриональных стволовых клеток человека высокой плотности, окруженные эмбриональными фибробластами мыши.

Метод аспирации позволяет удалить MES, в результате чего образуются небольшие ненарушенные колонии эмбриональных стволовых клеток человека. Благодаря минимальному количеству MES вокруг целой колонии, эмбриональные стволовые клетки способны к значительному расширению, образуя очень крупные колонии. Например, данная колония эмбриональных стволовых клеток человека, показанная сразу после истощения запаса метионина, превратилась в очень крупную колонию, что подтверждается иммунофлуоресцентной идентификацией колоний спустя 10 дней после истощения метионина.

Результаты истощения показывают, что колонии сохраняют экспрессию маркеров плюрипотентности и не проявляют признаков дифференцировки в мезодермальном направлении. На этих изображениях в проходящем свете представлена морфология колоний, окрашенных методом иммунофлуоресценции, при различных увеличениях. DAPI окрашивает ядра клеток.

Важно отметить, что эмбриональные стволовые клетки человека экспрессируют маркеры стволовых клеток человека SSEA-4, TRA-1-60 и TRA-1-81. Обратите внимание, что на изображениях представлена колония с типичными гладкими краями. Они не экспрессируют FLK-1, ранний маркер дифференцировки мезодермы, и не содержат фибробластов, о чем свидетельствует отсутствие окрашивания на DDR2.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как изолировать колонии стволовых клеток человека, используя методы культивирования для манипулирования природной средой. После освоения данного метода эта процедура будет занимать всего несколько секунд. Также не забудьте следить за тем, чтобы ваши культуры не пересыхали при удалении среды и слоев загрязнений.