Инжиниринг двухслойных гидрогель для управления ASC дифференциации

Общая цель этой процедуры заключается в создании композитной матрицы из природных биоматериалов, которая может быть использована для доставки и дифференцировки стволовых клеток для содействия заживлению ран. Это достигается путем выделения стволовых клеток, полученных из жировой ткани, или СК от подопытного животного. Затем A SC загружаются на предварительно изготовленные микросферы хитозана.

Затем отливается фибриллированный коллагеновый гель, а на коллагеновый гель наслаиваются шарики A-S-C-C-S-M. Наконец, фибриновый гель PEG наносится на коллагеновый гель A-S-C-C-S-M и добавляется среда. В конечном счете, могут быть получены результаты, показывающие двунаправленную одновременную миграцию A SC из гранул CSM в матрицы коллагена и фибрина ПЭГ.

С помощью этой процедуры один единственный источник стволовых клеток может получать дифференцированные сигналы от микроокружения коллагена и фибрина ПЭГ и дифференцированно стимулироваться для производства плейотропных факторов и формирования сети пресосудистых структур. Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как композиты из одного материала или децеллюляризованные заменители кожи, заключается в том, что эти другие продукты не участвуют в активной реваскуляризации продукта хозяином. Идея этого метода пришла нам в голову, когда мы заметили, что изолированный RAD A SE имеет склонность к дифференцировке в сторону сосудистого фенотипа при культивировании в фибриновом матриксе свиньи.

Это наблюдение породило идею о том, что один источник стволовых клеток может быть использован одновременно в системе, состоящей из различных биоматериалов. После выделения и культивирования стволовых клеток, полученных из жировой ткани или ASC, получения микросфер хитозана или CSM и загрузки ASC в CSM, получить полиэтиленгликоль, фибрин гидрогель путем растворения сукцинилглюта, дератации модифицированного PEG в четырех миллилитрах трис-буферного раствора. Непосредственно перед экспериментом используйте фильтр 0,22 микрона для стерилизации раствора.

В питательной лунке из смеси с шестью лунками 500 микролитров фибриногена и 250 микролитров запаса ПЭГ инкубируют в течение 20 минут в инкубаторе с 5%-ным увлажнением углекислого газа при температуре 37 градусов Цельсия. Далее смешайте 250 микролитров предварительно приготовленных A-S-C-C-S-M с пегилированным раствором фибриногена, немедленно добавьте один миллилитр исходного раствора тромбина и с помощью пипетки быстро трижды один или два раза сразу поместите клеточную гелевую смесь в 12-луночную пластину и инкубируйте в камере с 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут. Затем дважды промойте полученный колышек фибрином с помощью HBSS и инкубируйте с альфа-минимальной эфирной средой с добавлением 10% FBS в инкубаторе с 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия с использованием стандартных методов световой микроскопии в течение 11 дней.

Наблюдайте за миграцией клеток из CSM в гелевую смесь A-S-C-C-S-M с коллагеном первого типа, экстрагированным из сухожилий крысиного хвоста с использованием двух нормальных гидроксидов натрия. Отрегулируйте pH до 6,8 и фибриллят. Добавьте фибриллированный коллаген, смесь A-S-C-C-S-M в 12-луночный планшет и инкубируйте в инкубаторе с 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут.

Убедившись, что фибрилляция завершена, инкубируйте гели с коллагеном A-S-C-C-S-M в течение 11 дней в инкубаторе с 5% увлажненным углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия. Наблюдайте за миграцией клеток из CSM в гель в течение 11-дневного периода с использованием стандартных методов микроскопии для разработки двухслойной конструкции для изучения миграционных и коиндукционных свойств одного источника стволовых клеток. Использование двух биокаркасов.

Приготовьте гели с коллагеном и фибрином ПЭГ со следующими небольшими модификациями, приготовьте один миллилитр 7,5 миллиграммов на миллилитр коллагена. Затем переложите смесь в шестилуночный вкладыш для культуры тканей и инкубируйте в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия. После полной фибрилляции уложите на поверхность коллагена 200 микролитров пяти миллиграммов A-S-C-C-S-M в питательную среду.

После того, как микросферы осядут на геле, приготовьте фибриновый гель ПЭГ, используя 250 микролитров среды для клеточных культур. Затем нанесите слой пегилированного раствора фибриногена тромбина на слои коллагена A-S-C-C-S-M. После завершения инкубируйте конструкции в течение 30 минут в инкубаторе, увлажненном углекислым газом с 5% содержанием углекислого газа, чтобы достичь полного завершения.

Наконец, поместите один миллилитр среды в верхнюю камеру над конструкцией и три миллилитра среды в нижнюю камеру. Характеристика СК, встроенного в этот каркас, показала, что загруженные СК СК могут быть зажаты между слоем коллагена и ПЭГ-фибрина одновременно и дифференцированно получать сигналы от обеих внеклеточных сред для процветания в новых условиях. Как показано здесь, коллаген поддерживает способность ASC оставаться стволовыми клетками, о чем свидетельствует их экспрессия stro one зеленого цвета, а также их морфология, подобная фибробластам.

Напротив, фибрин ПЭГ индуцировал ASC к дифференцировке в сторону аваскулярного фенотипа, о чем свидетельствует их трубчатая морфология, показанная здесь, в комплекте с просветом и специфичной экспрессией эндотелиальных клеток фактора фон Виллоу Брананда, показанной здесь красным цветом. Кроме того, как показано здесь, эти наблюдаемые фенотипы, по-видимому, встречаются на ранних этапах культуры и сохранялись в течение 11 дней. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выделять стволовые клетки, полученные из жировой ткани крыс, загружать их в чито и микросферы и включать в двухслойный гидрогель с использованием биоматериалов, одобренных FDA.

Не забывайте, что биоматериалы и клетки, которые используются в этом протоколе, получены от животных и людей и могут быть чрезвычайно опасными, если они заражены патогенами своего хозяина. При выполнении этих процедур всегда следует принимать меры предосторожности, такие как средства индивидуальной защиты и методы асептического культивирования клеток.