Крысы Брыжейка экстериоризации: модель для исследования Клеточная динамика, вовлеченных в ангиогенез

Целью следующего эксперимента является определение пространственной и временной клеточной динамики, участвующей в ангиогенезе, под которым понимается рост новых кровеносных сосудов из уже существующих. Используя простую воспроизводимую модель, сначала стимулируйте ангиогенез путем кратковременной экстернализации брыжейки крысы, затем соберите ткани брыжейки в разные моменты времени после стимуляции. Затем проведите иммуномаркировку срезов тканей.

Например, используйте маркер эндотелиальных клеток для визуализации всей ремоделирующейся сосудистой сети внутри ткани и создания необходимой двумерной визуализации растущих микрососудистых сетей. Данная модель привлекательна тем, что обеспечивает резкое увеличение нескольких ангиогенных показателей за относительно короткий общий период времени. Визуализация сетей на уровне отдельных клеток и корреляция этих показателей с многоклеточным мечением оказались крайне полезными для идентификации новых клеточных фенотипов, связанных с прорастанием капилляров.

Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы, касающиеся клеточной динамики, участвующей в росте микрососудистой сети. К ним относятся вопросы о том, когда и где конкретные клетки присутствуют в процессе прорастания капилляров. Основными преимуществами этого метода являются его простота, минимальное хирургическое вмешательство и формирование выраженного ангиогенного ответа за относительно короткий период времени.

Кроме того, данный метод использует брыжечку (rap mesentery) — ткань, которая позволяет наблюдать за целостной сетью вплоть до уровня отдельных клеток. По нашему опыту, этот метод очень легко освоить, и, следовательно, он легко воспроизводится разными исследователями при демонстрации процедуры. Сегодня Питер Стэплер, аспирант нашей лаборатории, подготовит всё для проведения операции согласно детальному описанию в сопровождающем тексте.

После выбривания шерсти в области живота поместите анестезированную крысу на спину на грелку для поддержания температуры тела. Очистите область живота, поочередно протирая её стерильными марлевыми салфетками, смоченными в 70% изопропиловом спирте и йоде. Примерно на одном дюйме ниже грудины сделайте небольшой продольный надрез кожи, а затем — по белой линии живота. Наложите предварительно вырезанную салфетку-драпировку на область живота так, чтобы отверстие совпадало с надрезом. Осторожно надавите вокруг надреза, чтобы обнажить тонкий кишечник. С помощью ватных тампонов аккуратно извлеките участок тонкого кишечника, выложив брыжейку на пластиковый предметный столик со стерильным физиологическим раствором, и найдите подвздошную кишку.

Выберите от шести до восьми васкуляризированных брыжеечных окон — тонких полупрозрачных мембран между парами артерий и вен, питающими тонкий кишечник. Зафиксируйте время начала экспозиции и установите таймер на 20 минут. Пометьте два центрально расположенных брыжеечных окна стерильной шовной нитью 7-0 в области жировой ткани рядом с кишечником.

Периодически доливайте физиологический раствор в чашку Петри с помощью стерильного шприца объемом 5 мл, чтобы ткань оставалась погруженной и увлажненной. По истечении времени экстернализации верните брыжейку в брюшную полость. Зашейте мышцы брюшной стенки монофиламентной шовной нитью 5-0 прерывистым швом.

Затем зашейте кожу однонитевым шовным материалом размера 4-0 отдельными узлами; протрите область шва стерильной марлей, смоченной в 70% изопропиловом спирте и йоде. Нанесите увлажняющий гель на оба глаза крысы и поместите животное обратно в клетку для восстановления. В назначенный день после стимуляции проведите анестезию и эвтаназию крысы в соответствии с правилами учреждения. Затем снова вскройте брюшную полость и накройте область живота куском пищевой пленки. Осторожно извлеките тонкий кишечник и с помощью пинцета и микрохирургических ножниц найдите два отмеченных окна.

Вырежьте каждое из экстериоризированных брыжеечных окон, захватывая край жировой ткани. Старайтесь не пересекать пары артерий и вен в пределах жирового края окон, чтобы минимизировать возможное заполнение окон кровью. Также постарайтесь не повреждать кишечник, чтобы избежать попадания кишечного содержимого.

Сразу после извлечения погрузите каждое окно в PBS. Затем с помощью пинцета разложите ткани на положительно заряженных предметных стеклах, размещая по два образца ткани на одно стекло. После частичного высыхания тканей удалите излишки жира лезвием скальпеля.

Зафиксируйте образцы в метаноле в течение 30 минут при температуре −20 °C, поместив их в морозильную камеру. Высушите стекла в вакууме, чтобы удалить излишки буферного раствора. Также обведите ткани восковым карандашом, чтобы предотвратить неконтролируемый вытекание растворов антител за пределы ткани.

Теперь капните примерно 200 µL раствора разведенных первичных антител, чтобы покрыть всю ткань. Инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре, затем промойте ткани в PBS с добавлением 0,1% sapin, трижды заменив буфер. Далее добавьте раствор вторичных антител с пероксидазой strep adin и инкубируйте при комнатной температуре в течение одного часа; после трех промывок инкубируйте образцы в vector nova red в течение 15 минут.

Промойте водой перед закреплением на предметных стеклах. Погрузите в 95% ethanol 10 раз, затем проведите последовательные этапы дегидратации. Дайте стеклам высохнуть, нанесите на ткани тонкий слой среды и закройте покровными стеклами после вакуумной сушки и маркировки.

Стекла. Покройте образцы тканей разведенным раствором первичных антител. Инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре.

Промойте трижды раствором PBS с добавлением 0,1% сапонина, выдерживая по 10 минут при каждой промывке. Затем добавьте вторичный антитело и инкубируйте в течение одного часа. Выполните промывки в растворе PBS с 0,1% сапонина, закройте стекла покровными стеклами, используя PBS с глицерином, и загерметизируйте края лаком для ногтей.

Ниже подробно описана модификация стандартной чашки Петри для использования в качестве операционного столика. Желтый модельный пластилин был использован для создания гладкой поверхности, через которую брыжеечный отдел будет вытягиваться через предварительно проделанное отверстие. Еще раз отметим, что брыжеечные окна, показанные здесь на столике в период экстернализации, определяются как тонкие полупрозрачные мембраны между парами артерий и вен, питающими кишечник в этой области.

Маркировка PCAM позволяет идентифицировать все типы сосудов в иерархии ремоделируемых микрососудистых сетей в определенные моменты времени после экстернализации. Эти изображения могут быть использованы для количественного определения показателей ангиогенеза в определенные моменты времени после стимуляции.

Маркировка PCAM позволяет дифференцировать артериолы и венулы. Обратите внимание, что питающие артериолы обычно имеют меньший диаметр и более вытянутую морфологию эндотелиальных клеток по сравнению с парными венулами. Типичными характеристиками ремоделируемых сетей являются васкуляризированная область, спраутинг капилляров и плотность сосудов.

Количественное определение этих различных ангиогенных показателей позволяет охарактеризовать временной ход роста сети. Пик прорастания капилляров из уже существующих сосудов приходится на период между третьим и пятым днем, а к 10-му дню этот показатель возвращается к исходному уровню, характерному для нестимулированных образцов. В нашей лаборатории за этим временным увеличением прорастания следует увеличение васкуляризированной области и плотности сосудов.

Данная модельная система использовалась для выявления новых изменений клеточного фенотипа в определенные моменты времени в ходе этого процесса ремоделирования. Иммунофлуоресцентное окрашивание на PCA окрашивает эндотелиальные клетки в красный цвет, в то время как окрашивание на бета-тубулин III класса окрашивает нервы и паразитов вдоль ангиогенных сосудов в зеленый цвет. Примечательно, что в нестимулированных тканях экспрессия бета-тубулина III класса специфична для нервных волокон.

Напротив, в период пика капиллярного прорастания бета-тубулин третьего класса экспрессируется периваскулярными клетками. Такой результат подчеркивает полезность этой простой и надежной ангиогенной модели для идентификации новых типов клеток, участвующих в процессе ангиогенеза. К 10-му дню характер экспрессии бета-тубулина третьего класса начинает возвращаться к состоянию, характерному для нестимулированного сценария.

Эта модель также может быть потенциально использована для исследований клеточного происхождения. Возможность встраивания клеток в ремоделирующуюся ткань брыжейки подтверждается этими предварительными исследованиями, в которых предварительно маркированные клетки костного мозга или мезенхимальные стволовые клетки наносились на окна брыжейки в течение 20-минутного периода экстернализации. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как использовать нашу модель интернализации брыжейки крысы для изучения клеточной динамики, участвующей в росте микрососудистой сети.

Эту простую методику можно выполнить примерно за 45 минут или один час. Помните, что после хирургической процедуры крайне важно бережно обращаться с брыжейкой и избегать повреждения сосудов. Для идентификации различных типов клеток вдоль кровеносных сосудов можно провести иммуномаркировку.

Также можно провести маркировку лимфатических сосудов и нервов. Это позволяет исследовать не только клеточные фенотипические изменения, связанные с ангиогенезом, но и координацию между ангиогенезом, нейрогенезом и лимфангиогенезом.