Солюбилизации и Био-сопряжения квантовых точек и бактериальные анализы токсичности по кривой роста и плиты графа

Общая цель данной процедуры заключается в проведении высокопроизводительного скрининга антибактериального действия наночастиц с конъюгацией с антибиотиками или без нее. Для достижения этой цели в данной работе исследуется антибактериальный эффект квантовых точек теллурида кадмия, конъюгированных с полимиксином B. Сначала квантовые точки растворяют в меркаптопропионовой кислоте.

Затем квантовые точки конъюгируют с полимиксином B, после чего бактерии, высеянные на чашки с антибиотиками, обрабатывают как конъюгированными, так и неконъюгированными с антибиотиком квантовыми точками. Половину образцов подвергают облучению синим светом с длиной волны 440 nanometer в течение 30 минут, что вызывает генерацию экситонов и активных форм кислорода квантовыми точками для оценки влияния обработки квантовыми точками на рост и выживаемость бактерий. Измеряют оптическую плотность и проводят подсчет колоний. Полученные данные указывают на то, что применение квантовых точек теллурида кадмия, конъюгированных с антибиотиком, с последующим облучением вызывает наибольший бактерицидный эффект среди всех протестированных условий.

Хотя данный метод позволяет получить представление о влиянии квантовых точек теллурида кадмия и их конъюгации с полилизин B на рост E coli, он также может быть применен к другим типам наночастиц и антибиотиков на различных штаммах бактерий. Как правило, лица, впервые использующие этот метод, могут столкнуться с трудностями, поскольку любой избыток MPA приведет к агрегации квантовых точек, а если при этом будет выдавлено даже небольшое количество толина, это приведет к повреждению фильтра.

Хотя сегодня мы продемонстрируем метод оценки антибактериального действия квантовых точек KE IDE, конъюгированных с антибиотиком, аналогичный метод можно использовать и с другими типами квантовых точек, такими как фосфат индия, сульфат цинка и йодид кадмия-сульфат цинка. Начните процедуру с приготовления раствора квантовых точек теллурида кадмия или CDTE в толуоле с концентрацией 15 µM в стеклянном флаконе; измерьте оптическую плотность или OD методом абсорбционной спектроскопии, затем с помощью пипетки перенесите 200 µL этого стокового раствора в стеклянный флакон.

Не используйте пластик. Затем добавьте 800 µL толуола, 1 mL 200 mM боратного буфера и 2 µL 11,5 M меркаптопропионовой кислоты (MPA), плотно закройте флакон и энергично встряхивайте в течение 30–60 секунд. После встряхивания водная и органическая фазы разделятся спонтанно.

Водная фаза окрасится в цвет квантовых точек. Чтобы избежать попадания слоя плиток, удалите его, затем отберите фазу с квантовыми точками и перенесите ее в чистый флакон. Для очистки сольватированных квантовых точек перенесите их в центрифужный фильтр объемом 500 µL.

Добавьте 100 µL 50 мМ буфера bore eight и центрифугируйте при 3000 ×g в течение 13 минут. Повторите данную промывку четыре раза. После финальной промывки суспендируйте промытые квантовые точки в 500 µL буфера bore и храните при 4 °C.

Они будут стабильны в течение одной-двух недель. Для оценки концентрации квантовых точек измерьте спектры поглощения и испускания. На этом рисунке представлены квантовые точки CDTE под освещением УФ-лампой, а также спектры испускания до и после solubilization в воде, что демонстрирует незначительное изменение оптических свойств в результате обмена лигандов.

Эта часть протокола применима к любым отрицательно заряженным водорастворимым наночастицам, включая частицы мха, коммерческие квантовые точки, металлические частицы и другие. В данном примере антибиотик полимиксин B или PMB будет конъюгирован с квантовыми точками в молярном соотношении 30:1. PMB имеет положительный заряд и самособирается без необходимости в конъюгации. Реагенты: растворите PMB в воде.

При концентрации 60 мкМ. Для 96-луночного планшета с 0,3 мл бактерий на лунку в четырехкратных повторностях достаточно 0,5 мл конъюгата с концентрацией 200 нМ; для этого в микроцентрифужную пробирку добавляют 100 мкл квантовых точек с концентрацией 1 мкМ в 50 мМ боре-буфере.

Затем добавьте в пробирку с конъюгатом 50 µL раствора антибиотика PMB в воде с концентрацией 10x или 60 µM. В контрольную пробирку добавьте 50 µL воды. Доведите объем до 0,5 mL с помощью 50 mM ацетатного буфера. Защитите пробирки от света с помощью алюминиевой фольги и поместите их на ротатор на один час.

При возникновении агрегации повторите конъюгацию с использованием более низких концентраций антибиотика. Постепенно увеличивайте концентрацию до тех пор, пока частицы не перестанут агрегировать при промывке конъюгатов. Профильтруйте растворы через фильтр с пределом отсечения по молекулярной массе 10 000 Да, который подходит для большинства антибиотиков, но не для белков или антител.

Наконец, определите количество молекул антибиотика на одну квантовую точку с помощью абсорбционной или флуоресцентной спектроскопии, гель-электрофореза или ИК-фурье-спектроскопии. На этом рисунке показаны типичные спектры поглощения и испускания квантовых точек до конъюгации с PMB и спектр испускания после добавления 160 молярных эквивалентов PMB.

Здесь представлена зависимость между соотношением PMB и интенсивностью излучения квантовых точек (отмечена квадратами), а также положением пика длины волны (отмечено треугольниками). При увеличении концентрации PMB интенсивность излучения КТ снижается, что приводит к сдвигу пика длины волны излучения. Следующая часть протокола выполняется вечером за два дня до эксперимента по конъюгации для определения полумаксимальной ингибирующей концентрации или IC 50 антибиотика и квантовой токсичности.

Засейте 10 миллилитров среды LB колонией e coli из свежего посева. На следующий день, за один-два часа до начала эксперимента, заполните каждую лунку прозрачного 96-луночного планшета. Среда для роста в assay plate должна быть распределена так, как показано здесь.

Образцы следует высевать в трех повторностях, при этом концентрации антибиотиков должны охватывать достаточно широкий диапазон, чтобы включать одну концентрацию, которая оказывает минимальное ингибирующее действие на бактерии, и одну, которая полностью их уничтожает. Лунки, содержащие квантовые точки в концентрациях, предназначенных для использования в экспериментах с конъюгатами, также следует включать в трех повторностях. С помощью многоканального дозатора внесите в соответствующие лунки от 1 до 50 µL бактериальной культуры.

Концентрация будет зависеть от скорости роста конкретного штамма и должна быть соответствующим образом откалибрована. Для мониторинга роста поместите планшет в планшетный ридер и установите интервал считывания каждые 10 минут в течение двух часов при длине волны 600 нанометров. Когда все клетки достигнут OD от 0,1 до 0,15, извлеките планшет из ридера и остановите запись.

Затем добавьте PMB в квантовых точках в соответствующие лунки и в трехкратной повторности закройте половину планшета алюминиевой фольгой. После этого поместите планшет под специальную лампу с длиной волны 440 нм, состоящую из светодиодов мощностью 2.4 мВт, на 30 минут для облучения открытой стороны планшета. После воздействия света поместите планшет в планшетный ридер и регистрируйте OD 600 каждые 10 минут в течение от 5 до 12 часов, в зависимости от скорости роста. С помощью программного обеспечения поддерживайте температуру ниже 32 °C, если это возможно, чтобы избежать высыхания культур.

Постройте графики кривых роста в выбранный момент времени в зависимости от логарифма концентрации и определите IC₅₀ антибиотика, используя уравнение Хилла, представленное на экране, где H — коэффициент Хилла. Yₘₐₓ — наивысшая точка роста, а Yₘᵢₙ — нулевая точка, которая также в идеале должна находиться на плато. По окончании периода регистрации прозрачные лунки будут свидетельствовать о полной гибели клеток, при этом вдоль возрастающих концентраций препарата должен наблюдаться градиент плотности клеток.

Бактерии должны демонстрировать S-образные кривые роста, как показано здесь. Положение максимального плато будет сильно варьироваться в зависимости от штамма, а также зависеть от температуры. Можно выбрать определенную временную точку в качестве репрезентативной и построить график значений в зависимости от log антибиотика для определения IC 50 с целью оценки квантовых точек.

Также можно построить график выживаемости при токсическом воздействии в зависимости от логарифма концентрации квантовых точек, однако значительное уничтожение бактерий одними только квантовыми точками в используемой концентрации встречается редко. После определения токсичности квантовых точек и антибиотиков по отдельности тот же протокол можно применить для определения токсичности антибиотика. Показаны конъюгированные квантовые точки.

Ниже приведен пример схемы анализа. Обратите внимание, что конъюгаты тестируют в возрастающих концентрациях в четырехкратных повторностях; также следует включить контрольную полоску только с бактериями, полоску только с препаратом и лунки с образцами только с квантовыми точками. Затем показания OD 600 можно использовать для построения кривых роста и определения значений IC50, как и ранее.

На данном рисунке представлен пример конъюгатов, токсичность которых сопоставима с токсичностью одного только антибиотика, и пример конъюгатов с более высокой токсичностью. Чтобы определить количество колониеобразующих единиц (КОЕ) для каждого условия, выберите одну или несколько лунок обработанного 96-луночного планшета для проведения подсчета колоний. Выполните серийное разведение каждого из выбранных образцов бактерий физиологическим раствором.

Для этого внесите пипеткой 180 µL физиологического раствора в соответствующие лунки. Перенесите 20 µL бактериального раствора и разведите его в 180 µL физиологического раствора. Замените наконечник пипетки, перемешайте и перенесите 20 µL разведенного бактериального раствора в 180 µL физиологического раствора.

Повторите этот процесс шесть раз. Затем возьмите по 10 µL из последних шести разведений и нанесите их каплями на прямоугольный планшет для автоматического посева. На один прямоугольный планшет можно нанести до 36 капель.

Оставьте планшет подсохнуть на лабораторном столе в течение 15 минут, затем инкубируйте его при 37 °C в течение 16 часов. После инкубации подсчитайте количество колоний для определения количества колониеобразующих единиц на миллилитр. Умножьте число колоний на коэффициент разведения и разделите на объем высева, чтобы определить влияние обработки на рост бактерий.

Плотность клеток E. coli измеряли по OD 600. Здесь представлены репрезентативные кривые роста бактерий при различных концентрациях препарата — от нуля до полной гибели клеток. Открытые символы обозначают воздействие только PMB с указанными концентрациями.

Закрашенные символы обозначают C-D-T-E-P-M-B без облучения, а полузакрашенные — C-D-T-E-P-M-B с облучением. Облучение не оказало влияния на образцы, содержащие только PMB, поэтому эти кривые были опущены для наглядности. Ниже представлены графики значений кривой роста через 200 минут в зависимости от логарифма концентрации PMB, а также аппроксимации по этому уравнению для определения значений IC 50 с целью контроля влияния света.

Кривая построена только для антибиотика при 30-минутном воздействии света. На этом рисунке показана выживаемость бактерий через 200 минут в зависимости от концентрации квантовых точек (QD) с использованием CDTE qds. При воздействии света наблюдается некоторая токсичность, однако ее недостаточно для определения значения IC 50.

Это указывает на то, что токсичность одного лишь CDTE в концентрациях, использованных в эксперименте по конъюгации, незначительна для сравнения эффектов различных воздействий на рост клеток; значения кривой роста при 200 минутах были построены и аппроксимированы по приведенному ранее уравнению, как показано здесь. Конъюгаты C-D-T-E-P-M-B оказались более токсичными, чем один лишь PMB. Для сравнения, конъюгаты на основе золотых наночастиц A-U-P-M-B не продемонстрировали повышения токсичности по сравнению с одним лишь PMB при определении влияния воздействий на выживаемость бактерий.

Количество колониеобразующих единиц определяли для E. coli, размещенных в 96-луночном планшете и подвергнутых воздействию P-M-B-Q-D-P-M-B или только QD в присутствии или отсутствии облучения I в течение 30 минут с последующей инкубацией при 32 °C в течение четырех часов. Серийные разведения каждой пробы бактерий проводили в физиологическом растворе, после чего 10 µL растворов от 100-кратного до 10⁷-кратного разведения высевали на чашки с агаром. Чашки инкубировали при 37 °C, подсчет колоний проводили через 16 часов.

В данном примере в колонках планшета с A по C находятся бактерии, обработанные возрастающими концентрациями CDTE. Конъюгаты без облучения и колонки с D по F представляют собой бактерии, обработанные возрастающими концентрациями конъюгатов. Вдоль строк показаны разведения при 30 минутах облучения.

Данные указывают на то, что после облучения конъюгаты оказывают более сильное ингибирующее воздействие на рост бактерий по сравнению с конъюгатами без облучения. Не забывайте, что реагенты на основе Ca крайне токсичны, поэтому при выполнении данной процедуры необходимо всегда соблюдать меры предосторожности, такие как использование перчаток, лабораторных халатов и защитных очков. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить высокопроизводительный скрининг антибактериального эффекта наночастиц с конъюгацией к антибиотикам или без нее.