В пробирке Электропорация нижней губы Ромбическая эмбрионов мыши середине беременности

Общая цель данной процедуры заключается в манипулировании экспрессией генов в предшественниках заднего мозга эмбриона путем введения плазмидной ДНК с помощью электропорации на ранних сроках гестации. Это достигается путем предварительного выделения эмбрионов на 11,5 день гестации и их размещения дорсальной стороной вверх в стерильном фосфатно-солевом буферном растворе. На втором этапе вводят около 50 µL экспрессионной плазмиды в 0,01% fast green.

При успешном введении вся желудочковая система будет заполнена смесью ДНК и фаст-грина. Затем эмбрион подвергается воздействию электрического импульса. Сторона эмбриона, расположенная ближе к положительно заряженному электроду, поглотит плазмидную ДНК.

Другая сторона будет служить внутренним отрицательным контролем. Заключительным этапом является помещение эмбрионов в культуру тканей минимум на 24 часа. В конечном итоге электропорированный ген экспрессируется после 24 часов культивирования, что можно оценить с помощью иммуногистохимического анализа.

Преимущество данной методики по сравнению с существующими методами заключается в возможности манипуляций с прогениторами заднего мозга эмбриона на более ранних сроках гестации. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в данной области, например, о том, как различные нейральные гены могут влиять на судьбу эмбриональных прогениторов. Начните выполнение процедуры со стерилизации инструментов для диссекции и ламинарного шкафа в соответствии с сопроводительной рукописью.

Для извлечения эмбрионов поместите эвтаназированную беременную самку мыши с плодами на сроке гестации E 11.5 на диссекционный лоток в вытяжном шкафу. Затем обработайте живот мыши 70% ethanol. Вскройте брюшную полость и закрепите стенки булавками к диссекционному лотку.

Затем извлеките рога матки так, чтобы они находились в брюшной полости. С помощью пинцета осторожно вскройте стенку рога матки. Используя ложку диаметром 20 миллиметров, аккуратно извлеките эмбрионы в желточном мешке из плаценты.

После этого поместите эмбрионы в чашку для культивирования тканей диаметром 100 мм, предварительно заполненную 10 мл стерильного подогретого 1× PBS. На этом этапе перенесите первый эмбрион в новую чашку диаметром 100 мм, предварительно заполненную 10 мл стерильного 1× PBS, подогретого до 37 °C.

Затем осторожно удалите и выбросьте желточный мешок. После этого расположите эмбрион дорсальной стороной вверх. Аккуратно зафиксируйте эмбрион с помощью электродов шириной 7 мм под диссекционным микроскопом.

Разместите электроды по обе стороны нервной трубки на уровне четвертого желудочка ромбомозга. После этого с помощью шприца объемом 1 cc наберите смесь плазмидной ДНК и 0,01% Fast screen; обычно 500 microliters этой смеси достаточно для электропорации как минимум восьми–десяти эмбрионов. Затем осторожно проколите крышную пластинку над четвертым желудочком с помощью туберкулиновой иглы калибра 25 gauge и длиной five eighth, прикрепленной к шприцу объемом 1 CC.

Затем введите около 50 µL смеси ДНК и DI в желудочек. При успешном введении смесь ДНК и DI заполняет всю желудочковую систему. Альтернативным способом доставки смеси ДНК и DI является доступ к желудочковой системе путем прокола веллума, перекрывающего средний мозг; затем включите импульсный генератор и подайте пять прямоугольных импульсов, используя электродный импульсный генератор и электроды-лопатки размером 7 мм в ткани, расположенной ближе всего к положительно заряженному электроду.

Пока происходит захват плазмиды в ламинарном шкафу, заполните лунки 12-луночного культурального планшета двумя миллилитрами среды DME MF 12, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки, 5% лошадиной сыворотки, 1% глутамина, 1% пенициллина-стрептомицина, предварительно нагретой до 37 °C. Затем зажмите эмбрион в средней части пинцетом. После этого удалите заднюю часть эмбриона и поместите переднюю часть в одну из заполненных лунок культурального планшета.

Повторите процедуру для всех эмбрионов и заполните только внешние лунки 12-луночного планшета. Чтобы избежать контаминации культур, культивируйте эмбрионы в инкубаторе при 37 °C с 5% carbon dioxide в течение 24 часов для экспрессии электропорированной плазмиды. Если требуется более длительное время культивирования, заполните лунки нового 12-луночного планшета двумя миллилитрами среды D-M-E-M-F 12.

Перенесите эмбрионы стерильной ложечкой в лунки нового планшета. Затем поместите их обратно в инкубатор при 37 °C и культивируйте до 48 часов для фиксации эмбрионов перед анализом. Наполните 12-луночный планшет 1× PBS, затем перенесите туда эмбрионы и промойте их при 4 °C в течение пяти минут.

Затем зафиксируйте эмбрионы в 2% паральдегиде в 1× PBS в течение двух часов при температуре 4 °C. После этого трижды промойте их в 1× PBS при 4 °C по пять минут. Затем заполните новый 12-луночный планшет 30% сахарозой в 1× PBS.

Перенесите эмбрионы в соответствующие лунки и выдержите их в течение ночи при температуре 4 °C для уравновешивания. Затем включите эмбрионы в состав для оптимальной температуры резания (OCT), используя смесь сухого льда с этанолом, или храните их при температуре -20 °C. В завершение выполните серийные срезы эмбрионов толщиной 30 мкм с помощью криостата.

Закрепите их на предметных стеклах и храните при температуре -20 °C от uni Histochemical. В последующем исследовании, результаты которого представлены здесь, показаны репрезентативные данные иммуногистохимического анализа на GFP на поперечных срезах электропорированного эмбриона E 11.5 после 24 часов культивирования. Стрелки указывают на крышную пластинку, в которой удерживается вторичный антитело.

Результаты показывают, что область электропорации нижней губы ROIC была ограничена и не распространялась на всю передне-заднюю ось нейральной трубки. Здесь представлены результаты анализа двух белков: MASH one и math one. Мы заметили, что большинство эмбрионов сохраняют нормальный уровень экспрессии после электропорации и культивирования по сравнению с контрольными эмбрионами на стадии 11.5. После освоения эта методика может быть выполнена за один-два часа при условии правильного проведения процедуры.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как использовать метод электропорации in vitro для манипулирования экспрессией генов в клетках-предшественниках эмбриональной мембраны мыши.