Визуализация и анализ потока крови и потребления кислорода в печеночной микроциркуляции: применение к модели острого гепатита

Была разработана оптическая система для визуализации микроциркуляции печени с помощью флуоресцентно меченых эритроцитов и измерения парциального давления кислорода в микрососудах с помощью лазерной фосфовизуализации. Этот метод может быть использован для исследования физиологических и патологических механизмов путем анализа структуры микрососудов, диаметра, скорости кровотока и напряжения кислорода. При микроциркуляции печени кровь течет от портальной ЭС к центральной ЭС, создавая градиент кислорода между ними.

Концентрация кислорода в печени влияет как на экспрессию ферментов, так и на патологию, делая анализ кровотока и измерение кислорода. Важные темы исследований. Наш экспериментальный метод заключается в внутривенном введении эритроцитов, меченных флуоресцентными

Чтобы визуализировать микроциркуляцию с помощью флуоресценции для измерения парциального давления кислорода, мы вводим внутривенно порфирин палладия, который излучает фосфоресцию в кровоток при возбуждении лазером в степени, зависящей от концентрации окружающего кислорода. Этот процесс позволяет проводить количественный анализ кислорода, измерение парциального давления, микроциркуляция печени показала портальный и центральный венальный парциальное давление кислорода 59,8 и 38,9 миллиметров ртутного столба соответственно, демонстрируя эффективное измерение концентрации кислорода. Затем мы применили эту методологию к модели гепатита.

Мы обнаружили повышенное парциальное давление кислорода в портальной ES синусоидальной и центральной эс, но уменьшенную разницу давлений между портальной и центральной эс. Вероятно, это связано со снижением потребления кислорода в центральной венальной области из-за некроза гепатоцитов. Полученные результаты показывают, что наша методика использования оптической системы для измерения печеночной гемодинамики и потребления кислорода способна выяснить механизмы развития различных заболеваний печени в печеночной микроциркуляции.

Градиент кислорода является важным параметром, включающим экспрессию ферментов в перипортальных и парацентральных областях, виды заболеваний печени, связанные с микрораспределением, поэтому важно количественно оценить кровоток и потребление кислорода. Чтобы прояснить механизмы, преимущество нашего метода заключается в том, что бесконтактное и непрерывное оптическое измерение может количественно оценить кровоток, диаметр взрывных сосудов и градиент кислорода в печеночной микроциркуляции. У донорской мыши брали цельную кровь, и эритроциты дважды промывали PBS центрифугированием при 400 G в течение пяти минут.

Затем растворите два миллиграмма FITC в одном миллилитре, 100 миллимолярах DI гидрофосфата натрия перед фильтрацией через пористую мембрану размером 0,2 микрона. Затем поместите в пробирку один миллилитр раствора FITC вместе с 0,15 мл трехмиллимолярного раствора Декстеринга, 0,25 мл 180 миллимолярного DI гидрофосфата натрия и 1,5 мл 100 миллимолярного DI гидрофосфата натрия и перемешайте в тачке. Держите его при комнатной температуре в течение двух часов, прежде чем дважды простирать испачканные эритроциты PBS.

Затем поместите небольшое количество суспензии эритроцитов на предметное стекло и подтвердите как нормальный внешний вид, так и достаточную флуоресценцию Суспендируйте 0,1 миллилитра эритроцитов в 0,9 миллилитрах PBS и держите его при четырех градусах Цельсия до следующего использования, растворите 500 миллиграммов BSA в 10 миллилитрах PBS. Затем добавьте 30 миллиграммов палладиевого порфирина и перемешайте в течение ночи центрифугу, раствор удалите любой нерастворенный палладий порфирин и отфильтруйте натин SUP через мембрану размером 0,2 микрона, один миллилитр фильтрата в пробирки и храните при температуре минус 20 градусов Цельсия. Позаботьтесь о том, чтобы не допустить повторного замораживания и размораживания.

Чтобы визуализировать микроциркуляцию под микроскопом, вырежьте отверстие диаметром 20 миллиметров в пластиковой пластине и закройте отверстие квадратным покровным стеклом со стороной 30 миллиметров. Разложите основную долю печени на пластиковую пластину в положении лежа после канюляции хвостовой вены. Затем используйте несколько секций полиэтиленовой пищевой пленки размером три на восемь миллиметров, чтобы покрыть область вокруг мочки, чтобы предотвратить движение от дыхания и высыхание.

Визуализируйте печеночное кровообращение с помощью просвечивающего микроскопа и подтвердите, что в поле зрения нет застоя кровотока в течение как минимум 15 минут. Для наблюдения за кровотоком постепенно вводите инъекции. Нанесите два миллилитра флуоресцентно помеченных эритроцитов.

Для измерения парциального давления кислорода вводят 0,2 миллилитра раствора палладия-порфирина. Эритроциты, помеченные FITC, будут составлять одну 50-ю часть всех эритроцитов, находящихся в обращении в визуализируемой области, возбуждать FITC путем облучения его ртутной лампой, пропущенной через полосовой фильтр от 450 до 490 нанометров, и регистрировать флуоресценцию с помощью ПЗС-камеры. Фосфоресценция палладия и порфирина относительно слаба и требует высокочувствительного детектора и затемненного помещения.

Пики поглощения палладий-порфирина составляют около 410 и 532 нанометров, а вторая гармоническая длина волны рекомендуется 532 нанометра. Эта длина волны создается неодимовым YAG-импульсным лазером, который подключает лазерный луч к инвертированному микроскопу и настраивается таким образом, чтобы луч освещал центр фокальной плоскости. Пространственное разрешение лазера зависит от размера пятна, которое можно отрегулировать, пропустив луч через точечное отверстие.

Также прикрепите к микроскопу фильтр длинных проходов и фотоумножитель для обнаружения фосфоресценции. ФЭУ должен быть чувствителен к красным длинам волн, особенно около 700 нанометров. Выполните выборку фосфоресцирующего сигнала и вычислите постоянную времени затухания, применив экспоненциальную функцию.

В этом эксперименте мы отобрали 500 точек с частотой 200 килогерц. Для калибровки приготовьте два раствора палладий-порфирина с парциальным давлением кислорода 150 и нулем миллиметров ртутного столба каждый. Для получения нулевого миллиметра ртутного раствора добавьте в образцы 1% дихи натрия, чтобы создать условия, при которых кислород отсутствует во время калибровки.

Поддерживайте pH образца на уровне 7,4 и температуру 37 градусов по Цельсию. Расположите мышь на предметном столике микроскопа и отрегулируйте микрососуды, для которых вы хотите визуализировать микроциркуляцию печени до точки лазерного пятна быстрым мышам со свободным доступом к воде на ночь, введите ацетаминофен в дозе 200 мг на килограмм внутрибрюшинно через 24 часа после инъекции, обезболите мышь и обнажите печень со срединным разрезом. Если есть гепатит, то он будет легко заметен невооруженным глазом через некроз в парацентральной области.

Наше измерение парциального давления кислорода и микрососудов печени у мышей показало среднее давление кислорода для портальных es, синусовых почв и центральных вен 59,8, 48,2 и 38,9 мм ртутного столба соответственно. Другими словами, градиент кислорода от портальной к центральной ЭС указывает на достаточное выделение кислорода из эритроцитов при их прохождении через синусоиды. Мы подготовили мышей с индуцированным ацетаминофеном гепатитом для измерения микрососудов печени.

В качестве примера модели патологии мы обнаружили, что парциальное давление кислорода в портных венах, синусоидальных и центральных E было выше в группе ацетаминофена по сравнению с нормальными мышами. Перепад парциального давления кислорода между портальной и центральной ветвями составлял 20,9 миллиметра ртутного столба для нормальных мышей и 16,9 миллиметра ртутного столба для мышей модели гепатита. Перепад парциального давления кислорода между портальной и центральной ветвями составлял 20,9 миллиметра ртутного столба для нормальных мышей и 16,9 миллиметра ртутного столба для мышей модели гепатита.

Градиент кислорода в микроциркуляции печени в основном возникает из-за поступления кислорода из портальной вены, который потребляется гепатоцитами, некроз гепатоцитов в центральной области вен, вызванный ацетаминофеном, приводит к снижению потребления кислорода, последующей микроциркуляции и, следовательно, проблемам, связанным с гемодинамикой. Поступление и потребление кислорода участвуют во многих формах заболеваний печени. Мы построили модель острого гепатита и обнаружили увеличение напряжения кислорода в микрососудах.

Наша оптическая система может быть использована для исследования физиологических и патологических механизмов путем анализа структуры микрососудов, а также распределения потока и потребления кислорода.