Α-тест: Быстрая бесклеточной CD4 Перечисление Использование Всего слюны

Существует острая необходимость в доступных методах подсчета CD4 для мониторинга ВИЧ-инфекции в регионах с ограниченными ресурсами. В данном видео демонстрируется недорогой экспресс-тест для диагностики по месту оказания медицинской помощи, в котором количество CD4 определяется на основе содержания ингибитора протеиназы Alpha-1 PI в слюне. Для этого испытуемому или пациенту сначала дают лимонную леденцовую конфету для стимуляции выделения серозной жидкости в слюну.

Слюну собирают в контейнер для образцов и переносят в 96-луночный планшет для анализа. Затем к слюне добавляют насыщающее количество протеиназы — свиной панкреатической эластазы, которая связывает и ингибирует альфа-1-антитрипсин. Далее добавляют колориметрический субстрат эластазы.

Весь оставшийся несвязанный эластаз расщепляет субстрат, что приводит к изменению цвета с прозрачного на желтый. В лунки добавляют кумасси синий для окрашивания общего белка, после чего с помощью микропланшетного ридера проводят колориметрические измерения. В конечном итоге определяется соотношение альфа-1-ингибитора протеаз к общему белку, которое используется для точной оценки количества CD4 на основе индекса.

Данный метод обладает несколькими преимуществами по сравнению с существующим способом — проточной цитометрией. Анализ может быть проведен в полевых условиях без забора крови, который является травматичной и дорогостоящей процедурой, без использования дорогостоящих моноклональных антител, без необходимости в специальном техническом образовании, а также без потребности в охлаждении или транспортировке образцов. Этот метод преодолевает критический барьер в борьбе со СПИДом и должен оказать значительное влияние на стоимость лечения, показатели здоровья пациентов и частоту передачи ВИЧ, что в совокупности окажет существенное влияние на мировую экономику.

Данный метод позволяет понять, как Alpha-1-антитрипсин регулирует количество T-хелперов (CD4+ T-клеток) посредством адгезии и миграции, однако его также можно применить к другим системам, например, для изучения того, как другие белки-ингибиторы регулируют адгезию и миграцию других типов клеток. Идея этого метода возникла у нас после того, как мы обнаружили, что уровень Alpha-1-антитрипсина у пациентов с ВИЧ настолько низок, что это фактически ограничивает количество T-хелперов, попадающих в кровь. Начните выполнение протокола с приготовления необходимых рабочих растворов для каждого используемого микропланшета.

Приготовьте 60 миллилитров 0,05 молярного трис-буферного раствора (TBS) с pH 7,8. Кроме того, для каждого микропланшета приготовьте шесть миллилитров поросячьей панкреатической эластазы первого типа (PPE). Тщательно перемешайте суспензию PPE, затем разбавьте ее в TBS до концентрации примерно 0,01 ед/мл.

Затем приготовьте 0,1 M стоковый раствор колориметрического субстрата SA three NA в DMSO; этот стоковый раствор следует использовать сразу же или хранить при -20 °C, если он будет использован в ближайшее время. Приготовьте шесть миллилитров рабочего раствора для каждой микропланчинки, разведя стоковый раствор в TBS в соотношении 1:100. Наконец, приготовьте стоковый раствор 10% кумасси бриллиант синего R two 50 в TBS; используйте его сразу же или храните при -20 °C, если он будет использован в ближайшее время.

Подготовьте по шесть миллилитров для каждой микропластинки, разводя стоковый раствор в TBS в соотношении 1:1000. При работе со слюной важно соблюдать соответствующие меры предосторожности, такие как использование перчаток и лабораторного халата, при этом исследовательский субъект или пациент должен находиться в вертикальном положении. Поместите SGO в рот для стимуляции экссудации сыворотки.

Роль пациента с ВИЧ в данной демонстрации исполняет лаборант. Безсахарная лимонная леденцовая конфета удобна для пациентов с ВИЧ, которые часто страдают от отсутствия зубов и не могут жевать жвачку; ее следует рассасывать по мере необходимости в течение первых трех минут, а затем в течение следующих трех минут собирать слюну из всей полости рта в контейнер для образцов. Это позволит получить примерно 2 mL слюны.

Если слюна не будет использована немедленно, ее следует заморозить и хранить при температуре -80 °C до дня анализа, после чего образец необходимо нагреть до 37 °C. После размораживания слюну можно хранить при температуре от 2 до 4 °C в течение трех дней. Для проведения анализа каждый образец и контрольный образец наносят в трех повторностях на плоское 96-луночное планшета, добавляя по 130 µL TBS в каждую лунку с образцом и каждую контрольную лунку.

Затем, избегая попадания муцина, который обладает вязкостью и не содержит экссудата сыворотки, перенесите по 20 µL слюны в каждую из трех тестовых лунок и трех лунок отрицательного контроля. После этого добавьте по 20 µL TBS в лунки положительного контроля, перемешав содержимое с помощью пипетирования.

На этом этапе важно избегать перемешивания на вортексе, чтобы не создавать пузырьков при дозировании слюны, а также избегать попадания твердых частиц и слизи. Затем тщательно перемешайте рабочий раствор панкреатической эластазы (PPE) путем встряхивания, после чего добавьте по 50 µL в лунки с образцами, положительным контролем и отрицательным контролем.

Добавьте 50 µL TBS. Перемешивание не требуется, так как добавленного объема достаточно для равномерного распределения в смеси слюны. Инкубируйте планшет в течение 10 минут при комнатной температуре.

После инкубации добавьте в каждую лунку по 50 µL рабочего раствора субстрата эластазы SA three NA. Затем инкубируйте еще 45 минут при 23 °C. По истечении 45 минут добавьте в каждую лунку по 50 µL рабочего раствора красителя Кумасси синий.

Затем измерьте оптическую плотность на микропланшетном ридере при 405 нм для обнаружения расщепления SA тремя NA и при 595 нм для обнаружения кумасси синего, который представляет общее содержание белка. Чтобы рассчитать индекс alpha 1 PI, сначала используйте следующую формулу для получения нормированной оптической плотности для каждой длины волны, разделив разность между средним значением образца и средним значением отрицательного контроля на разность между средним значением положительного контроля и средним значением отрицательного контроля. Затем, чтобы получить индекс alpha 1 PI, разделите нормированную оптическую плотность при 405 нм на нормированную оптическую плотность при 595 нм, как показано здесь, чтобы определить, может ли тест alpha быть подходящим в качестве экспресс-теста для мониторинга количества CD4 в эндемичных регионах с ограниченными ресурсами.

Стимулированная слюна была собрана у 20 женщин и 11 мужчин с ВИЧ-инфекцией, посещавших клинику для планового обследования в Камеруне. В соответствии с предварительными наблюдениями, полученными при разработке альфа-теста с использованием слюны, собранной в Нью-Йорке, индекс alpha one PI и образцы слюны, собранные в Камеруне, коррелировали с количеством CD4 с коэффициентом R² равным 0,91 и значением P менее 0,0001. Эта зависимость была определена с помощью трехпараметрической сигмовидной кривой, что соответствует зависимости «доза-ответ». 95%-ные доверительный и прогностический интервалы изображены синей и красной линиями соответственно.

В предыдущем исследовании мы установили, что CD4-положительные T-клетки демонстрируют синусоидальную цикличность с периодичностью 23 ± 3,5 дня у лиц с ВИЧ-1 и у лиц с наследственной формой дефицита альфа-1-антитрипсина (α1-PI), PIZZ. Здесь представлен репрезентативный пример компьютерного анализа синусоиды цикличности CD4 у здорового контроля без ВИЧ с периодичностью 27 дней. Компьютерный анализ синусоиды изменений CD4-положительных T-клеток у шести субъектов позволил получить ожидаемые значения размаха колебаний (амплитуды от пика до пика) и оси осцилляции. Ось осцилляции коррелировала с амплитудой при значении R-квадрат 0,96 и p-значении 0,009.

У пациентов с низким количеством CD4-положительных Т-клеток циклические изменения числа CD4-положительных Т-клеток были незначительными, тогда как у пациентов с высоким количеством CD4-положительных Т-клеток циклические изменения были выраженными, поскольку представленная здесь линия регрессии оценивает ось осцилляции, а ось осцилляции коррелирует с амплитудой. Амплитуду можно рассчитать для линии регрессии, чтобы оценить, в каких пределах выше и ниже линии регрессии ожидаются колебания количества CD4-положительных Т-клеток вследствие циклических процессов; при наложении рассчитанной амплитуды и доверительного интервала было обнаружено, что амплитуда, обозначенная зеленой линией, находится в пределах 95% доверительного интервала, обозначенного синей линией.

После освоения данной методики время от сбора слюны до получения результата количества клеток CD4 пациента может составить 90 минут. Эта процедура предназначена для использования в качестве скринингового теста для мониторинга количества CD4. Если у пациента наблюдаются значительные изменения количества CD4, необходимо провести контрольное исследование методом проточной цитометрии, чтобы подтвердить достоверность измерений количества CD4 и помочь в принятии решений по лечению.

На следующем этапе разработки метод анализа на микропланшетах будет преобразован в технологию тест-полосок, что позволит проводить исследования без использования приборов или электричества. Передача ВИЧ через слюну маловероятна, однако у пациентов с ВИЧ часто встречаются и другие инфекционные заболевания, такие как туберкулез и гепатит C, поэтому следует помнить, что работа со слюной, как и работа с кровью, может быть крайне опасной из-за наличия неизвестных инфекционных частиц. При выполнении данной процедуры необходимо всегда соблюдать меры предосторожности, такие как использование перчаток и других средств индивидуальной защиты.