Ретроградная Загрузка нервов, урочища, и корешков спинного мозга с флуоресцентными красителями

Общая цель данной процедуры — введение высокой концентрации флуоресцентного или ион-чувствительного красителя в нейроны или любой нейронный тракт с использованием простого и недорогого метода. Это достигается путем предварительного изготовления двух типов пипеток: первого и второго типа. Затем к пипетке первого типа подсоединяют гибкую эластомерную трубку и создают положительное давление, чтобы затянуть целевой нейронный тракт в пипетку первого типа, убедившись в наличии надежного уплотнения.

Затем вставьте пипетку типа два в пипетку типа один и с помощью пипетки типа два аспирируйте остатки A CSF из пипетки типа один. После этого введите краситель в пипетку типа один, следя за тем, чтобы не попали пузырьки воздуха. Заключительным этапом является инкубация нейронов в темноте в течение от 6 до 20 часов.

В итоге, после извлечения пипетки первого типа, препарат готов к исследованиям in vitro, электрофизиологическим или морфологическим исследованиям. Основным преимуществом данной методики перед существующими методами, такими как бат-аппликация, инъекция в BOS и электропорация, является то, что D доставляется в определенную популяцию нейронов. Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии, касающиеся активности, связности, морфологии и распределения определенных нейронов.

Как правило, данная методика требует практики, в частности, обеспечения того, чтобы краситель не разбавлялся внутри пипетки первого типа и чтобы в неё не попадали пузырьки воздуха. Начните выполнение процедуры с вытягивания полиэтиленовой трубки над пламенем спиртовой лампы для изготовления двух коротких пипеток с сужающимися кончиками. Сначала вытяните короткую пипетку первого типа с узким кончиком, который может плотно фиксировать целевой корень или тракт.

Затем возьмите пипетку второго типа с более длинным и тонким стержнем и очень узким кончиком, который можно ввести в пипетку первого типа до самого её конца. После этого соедините пипетку второго типа с иглой калибра 19G с помощью зажима EC. Затем поместите изолированный спинной мозг в ванну.

На протяжении всего процесса заполнения промывайте его охлажденным A CSF. После этого установите пипетку типа один в держатель электрода так, чтобы ее заднее отверстие можно было легко соединить со шприцем с помощью гибкой трубки. В данной процедуре сначала наберите CSF в пипетку типа один с помощью шприца.

Затем нанесите контур аксонального тракта или корешка, который необходимо заполнить. После этого извлеките гибкую трубку из заднего отверстия. Затем присоедините пипетку второго типа к другому шприцу.

Вставьте её в пипетку первого типа, которой удерживают аксональный тракт или корешок нерва под микроскопом. С помощью шприца, присоединенного к пипетке второго типа, аспирируйте СМЖ A таким образом, чтобы остаток СМЖ A лишь покрывал аксональный тракт. Затем извлеките пипетку второго типа из пипетки первого типа.

В течение нескольких минут контролируйте уровень A CSF, чтобы убедиться в герметичности уплотнения аксонального тракта или нервов. После этого растворите краситель в A CSF или 0,2% Triton X 100 в дважды дистиллированной воде. Наберите раствор в пипетку второго типа, создавая слабое отрицательное давление с помощью присоединенного шприца, стараясь не допустить попадания пузырьков воздуха.

Затем введите пипетку второго типа, содержащую краситель, в остаточный раствор A CSF. Из пипетки первого типа медленно выпустите краситель в A CSF, осторожно создавая положительное давление с помощью шприца. Следите за тем, чтобы не допустить появления пузырьков воздуха и не вызвать смещение целевой ткани внутри наконечника. Если при введении красителя в пипетку первого типа образовался пузырек воздуха, удалите его, поднеся наконечник пипетки второго типа близко к пузырьку и осторожно создав слабое отрицательное давление с помощью подключенного шприца.

После высвобождения достаточного количества красителя извлеките пипетку второго типа. Затем инкубируйте ткань в темноте от 6 до 20 часов, в зависимости от типа эксперимента. По истечении времени, необходимого для заполнения, осторожно извлеките электрод из ткани.

Затем ткань готова к визуализации или гистологическому анализу. Ниже представлена схематическая диаграмма, демонстрирующая одновременное введение трех различных конъюгированных флуоресцентных красителей-декстранов в мотонейроны, сенсорные афференты и спинальные интернейроны; мотонейроны и сакральные сенсорные афференты были заполнены методом ретроградного транспорта Cascade blue Dextran и Texas red dextran через вентральные и дорсальные корешки соответственно. Зеленый флуоресцентный декстран был введен в спинальные интернейроны, аксоны которых поднимаются через вентральный канатик.

Здесь представлено конфокальное изображение среза крестцового отдела спинного мозга, в котором нейроны были помечены методом ретроградного маркирования. Обратите внимание, что помеченные сенсорные афференты расположены преимущественно ипсилатерально. При наличии нескольких контралатеральных проекций, помеченные моторные нейроны находятся ипсилатерально по отношению к заполненному вентральному корешку, в то время как помеченные интернейроны расположены контралатерально по отношению к нему, на что указывает наконечник стрелки.

После выполнения данной процедуры можно провести дополнительные исследования для ответа на ключевые вопросы, такие как функциональная связность, соотношение возбуждающих и тормозных влияний, тип синапсов, распределение и выработка нейромедиаторов в нейронах поля DI. Этот метод открыл исследователям в области нейрофизиологии спинного и продолговатого мозгов возможность выявления специфических популяций нейронов с помощью ионочувствительных красителей. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как вводить флуоресцентные и/или ионочувствительные красители в нейроны и сенсорные волокна изолированного спинного мозга.