Овариоэктомия и 17β-эстрадиола Замена у крыс и мышей: наглядная демонстрация
7 июня 2012 г.
Овариоэктомия и последующей заменой 17β-эстрадиола с помощью силиконовой капсулы и пероральный Nutella демонстрируются на крысах и мышах.
Общая цель данной процедуры заключается в установлении строгого контроля над концентрацией эстрогена в сыворотке крови самок крыс и мышей, которая в обычных условиях подвержена колебаниям. Это достигается путем предварительного удаления яичников через дорсальный разрез. Затем готовятся эластичные капсулы и смесь с Nutella.
Наконец, капсула вводится подкожно, либо смесь с Nutella вводится перорально. В конечном итоге результаты можно получить с помощью радиоиммунологического анализа, который показывает стабильные или колеблющиеся концентрации 17 beta estradiol в сыворотке крови для метода с капсулой и метода с Nutella соответственно. Основным преимуществом этих методов по сравнению с существующими, такими как пеллеты медленного высвобождения, является то, что они доказали способность обеспечивать физиологические концентрации estradiol в течение длительного периода времени.
Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области исследования эстрогенов, такие как различия в эффектах в зависимости от способа введения, путей проникновения и дозировок. После наркоза поместите животное в положение лежа на животе на нагревательную пластину, подключенную к ректальному термометру. Подкожно введите IGEL и препарат для послеоперационного обезболивания в латеральную область шеи животного.
Введите IL в дозе 5 mg/kg в физиологическом растворе передне-латерально от гребня подвздошной кости на область размером 4 × 4 cm. Затем продезинфицируйте область антисептиком и накройте животное хирургической простыней с отверстием 4 × 4 cm. Выполните срединный разрез длиной 2–3 cm и притупленным путем отделите кожу от подлежащей фасции на 1 cm латеральнее срединной линии.
Сделайте еще один разрез через фасцию. Затем, максимально поверхностно, выполните тупую латеральную диссекцию под этой фасцией до достижения брюшной полости. С помощью пинцета захватите жировую ткань, окружающую яичник в брюшной полости, и осторожно извлеките ее.
Найдите яичник и перевяжите рога матки и сосуды на расстоянии от 0,5 до одного сантиметра проксимальнее данной структуры. Вырежьте яичник и перевязанную жировую ткань, после чего верните оставшиеся ткани в брюшную полость.
Сделайте еще один разрез в фасции противоположной стороны и удалите второй яичник. Зашейте раны; если 17 beta estradiol не вводится немедленно, дайте животному выйти из наркоза.
Поместите животное в обогреваемую клетку минимум на два часа после операции. В первые несколько дней послеоперационного периода содержите крысу раздельно. Через 24 часа после операции подкожно.
Введите животным еще 5 mg/kg IL для введения 17 beta estradiol с помощью scholastic-капсул. Тщательно смешайте необходимое количество вещества с кунжутным маслом. С помощью пинцета отрежьте scholastic-трубки длиной 3 cm и деревянные аппликационные палочки длиной 5 mm для закупоривания.
Вставьте одну деревянную пробку в схоластическую капсулу перед введением раствора 17 beta estradiol в кунжутном масле. Чтобы заполнить капсулу по всей длине, осторожно закройте ее открытый конец другой деревянной пробкой. Инкубируйте капсулы в оставшемся растворе 17 beta estradiol в течение ночи перед имплантацией.
После закрытия разрезов после эктомии выбрейте и продезинфицируйте квадратную область размером 2х2 см на дорсальной стороне шеи крысы. Сделайте разрез длиной 1 см, затем осторожно раздвиньте ткани латерально тупым методом. Сформируйте подкожный карман, создав достаточное пространство для капсулы.
Протрите капсулу и аккуратно введите ее через разрез. Затем зашейте разрез с помощью шва. Убедитесь, что капсула оказывает минимальное натяжение на кожу, особенно в области раны.
Для использования орехового крема Nutella в качестве средства введения эстрогена тщательно растворите 17 beta estradiol в кунжутном масле, а затем смешайте кунжутное масло с ореховым кремом. За пять дней до начала эксперимента приготовьте плацебо — ореховый крем без содержания 17 beta estradiol. В течение первых трех дней приучайте крыс к поеданию орехового крема, не содержащего гормонов.
На четвертый и пятый дни проводите обучение животных в группах. В течение всего периода экспериментов скармливайте им ореховый крем в отдельных клетках. Помещайте животных в отдельные клетки при кормлении ореховым кремом с физиологическим сывороточным раствором.
Концентрации 17 beta estradiol, которые стремятся воспроизвести текущие методы, составляют примерно от 5 до 140 пг/мл для крыс и от 5 до 35 пг/мл для мышей. Как показано здесь. При введении самкам крыс линии Sprague Dawley массой 300 г.
Подкожные эластичные капсулы обеспечивают медленно снижающуюся концентрацию 17 beta estradiol в сыворотке крови: примерно от 40 пикограмм на миллилитр на второй день до 10 пикограмм на миллилитр к 35-му дню. Однако непосредственно после введения ожидается пик концентрации в сыворотке крови примерно 1000 пикограмм на миллилитр, который снижается до физиологического уровня в течение восьми часов при введении капсул самкам мышей линии C 57 black six массой 25 грамм.
При введении с помощью питательного крема крысам весом 300 г концентрация в сыворотке крови медленно снижалась с примерно 90 pg/mL на второй день до 25 pg/mL на 35-й день. Физиологические уровни 17-бета-эстрадиола у мышей ежедневно колебались в пределах от 10 до 70 pg/mL.
Уровни 17 бета-эстрадиола колебались от 20 до 120 pg/mL. После освоения метода процедура эктомии и имплантации капсулы может быть выполнена за 10 минут при условии правильного проведения. При выполнении данной процедуры важно строго соблюдать правила гигиены.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен метод контроля концентрации эстрогенов в сыворотке крови у самок крыс и мышей посредством оварииэктомии с последующим гормональным замещением. Методика включает использование силастиковых капсул и пероральной смеси с Nutella для поддержания стабильного уровня эстрадиола.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Эндокринология
- Модели животных
Теоретическая справка
- Овариэктомия является распространенной процедурой для изучения воздействия эстрогенов.
- Поддержание стабильного уровня гормонов имеет решающее значение для точности эксперимента.
- Традиционные методы могут не обеспечивать постоянную доставку гормонов.
- Новые методы направлены на повышение физиологической релевантности исследований.
Цель исследования
- Разработать надежные методы заместительной терапии эстрогенами на животных моделях.
- Сравнить эффективность использования силиконовых капсул и перорального введения.
- Оценить влияние этих методов на концентрацию эстрадиола в сыворотке крови.
Используемые методы
- Овариоэктомия у самок крыс и мышей.
- Приготовление силастиковых капсул и смеси Nutella для доставки гормонов.
- Подкожное введение капсул или пероральное введение Nutella.
- Измерение уровней эстрадиола в сыворотке крови методом радиоиммуноанализа.
Основные результаты
- Капсулы из Silastic обеспечивают стабильную концентрацию эстрадиола в сыворотке крови.
- Пероральное введение Nutella приводит к колебаниям уровней гормонов.
- Оба метода эффективны по сравнению с традиционными гранулами медленного высвобождения.
- Физиологические концентрации эстрадиола могут поддерживаться в течение длительного периода.
Выводы
- Новые методы обеспечивают улучшенный контроль уровней эстрогена в исследованиях.
- Капсулы из Силастика предпочтительны для стабильной доставки гормонов.
- Пероральный прием Nutella может быть использован, но может привести к вариабельности уровней гормонов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Контроль концентрации эстрогенов в сыворотке крови имеет решающее значение для воспроизводимости доклинических исследований в области нейронаук и эндокринологии, где гормональная вариабельность может исказить результаты валидации мишеней и механического анализа рисков. Данный метод позволяет поддерживать стабильный или физиологически колеблющийся уровень эстрадиола, что обеспечивает прогностическую достоверность на ранних этапах поиска и согласование трансляционных биомаркеров. Благодаря применению валидированных методов введения гормонов этот подход снижает биологический шум и повышает точность принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки в рамках приоритизации портфеля проектов.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать эстроген-зависимые пути, устраняя колебания уровня эндогенных гормонов.
- Практическая ценность: обеспечивает стандартизированное заместительное введение гормонов для изоляции независимых переменных в анализах по валидации мишеней.
- Прогностическая ценность: способствует механистическому снижению рисков за счет контролируемого воздействия гормонов, имитирующего сценарии клинического заместительного лечения.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Обеспечивает количественные, измеряемые показатели уровня эстрадиола с помощью радиоиммуноанализа для стандартизации анализа.
- Практическая ценность: Силастиковые капсулы обеспечивают длительное и стабильное высвобождение, подходящее для лонгитюдных скрининговых кампаний.
- Воспроизводимость: Метод с использованием Nutella позволяет проводить пероральное неинвазивное дозирование для высокопроизводительного фенотипического скрининга в случаях, когда колебания уровней допустимы.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для исследования заболеваний: моделирует физиологическое воздействие эстрогена, имеющее значение для женского здоровья и нейроэндокринных расстройств.
- Трансляционная преемственность: пероральное введение Nutella имитирует клиническую заместительную гормональную терапию, что улучшает экстраполяцию данных с доклинического на клинический этап.
- Оптимизация прогресса с учетом рисков: стабильная доставка с помощью капсул снижает вариабельность показателей эффективности и безопасности в доклинических исследованиях.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Этот метод интегрируется в фундаментальную биологию для проверки гипотез, поддерживает скрининг посредством стандартизированного гормонального прайминга и позволяет проводить трансляционные исследования с использованием клинически значимых путей введения.
- Открывательная биология: способствует уточнению сигнальных путей за счет устранения мешающего гормонального шума в моделях женских животных.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа за счет стабильного эндокринного фона, что снижает количество ложноположительных и ложноотрицательных результатов при оценке соединений.
- Аналитика: данные радиоиммуноанализа обеспечивают количественное измерение зависимых переменных для сравнения различных условий.
- Трансляционные исследования: пероральный путь введения Nutella способствует приведению биомаркеров в соответствие с клиническими парадигмами заместительной гормональной терапии.
- Повторное использование в организации: метод подготовки капсул и хирургический протокол могут быть повторно использованы в исследованиях, требующих эндокринного контроля.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышение прогностической достоверности за счет снижения механистической неопределенности в эстроген-опосредованном сигналинге.
- Операционная ценность: Стандартизированные хирургические процедуры и схемы дозирования повышают воспроизводимость результатов между различными центрами и группами исследователей.
- Стратегическая ценность: Оптимизация принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет минимизации биологической вариабельности в исследованиях эффективности.
- Влияние на портфель: Приоритизация проектов с учетом рисков благодаря использованию надежных гормонально-контролируемых моделей заболеваний.
Особенности реализации
- Требуется опыт проведения хирургических операций на грызунах и владение методами асептики для выполнения овариэктомии и имплантации капсул.
- Необходим доступ к силиконовым трубкам, кунжутному маслу, методу радиоиммунологического анализа, а также к Nutella или эквивалентному матриксу.
- Требуется межгрупповая стандартизация графиков дозирования и сроков забора сыворотки крови.
- Адаптация метода для разных видов (крысы в сравнении с мышами) требует корректировки дозы в зависимости от массы тела и скорости метаболизма.
- Практическое ограничение: метод с использованием Nutella приводит к колебаниям уровней гормонов, что делает его непригодным для исследований, требующих строгого гормонального контроля.
