Анализ легких созревание дендритных клеток и миграции в течение аллергического воспаления дыхательных путей

Целью данной процедуры является оценка созревания и миграции дендритных клеток (ДК) легких в ходе индуцированного Val Boomin аллергического воспаления дыхательных путей у мышей. Это достигается путем первоначальной сенсибилизации мышей препаратом Val Boomin с последующим воздействием на дыхательные пути Val Boomin, меченным fitsy. Затем производится забор легких и медиастинальных лимфатических узлов.

Наконец, из тканей легких и лимфатических узлов готовят суспензию единичных клеток. В конечном итоге с помощью проточной цитометрии можно оценить статус созревания и абсолютное количество дендритных клеток в средопозвоночных лимфатических узлах после введения FITC Val Boomin. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы о легочном иммунном ответе, например, подвергаются ли дендритные клетки созреванию при воздействии антигена и мигрируют ли они в дренирующие лимфатические узлы.

И если миграция происходит, то какова её скорость. Начните с по капельного добавления свежеприготовленного раствора Val Boomin в пробирку с алюминием в соотношении один к одному при перемешивании на вортексе. Перемешивайте смесь в течение 30 минут, затем наберите в шприц объемом 1 мл 0,2 мл полученной смеси.

Удерживая мышь за загривок у основания черепа большим и указательным пальцами одной руки, другой рукой введите раствор Val Boomin с адъювантом «алюм» в брюшную полость мыши. Через семь дней после второй инъекции Val в алюме зафиксируйте облеченное в алюминий сенсибилизированное животное под воздействием анестетика в вертикальном положении, затем с помощью стерильных наконечников для дозаторов по каплям нанесите 100 µL свежеприготовленного раствора val в fxi на NAS мыши.

Начните с закрепления катетера 20G на шприце объемом 1 мл. Затем, после подтверждения эвтаназии мыши, полностью раскройте грудную полость животного до самой шеи, чтобы обнажить трахею мыши и установить в нее канюлю. Крайне важно провести промывание легких и перфузию сердца, чтобы убедиться в удалении всех загрязняющих альвеолярных макрофагов и мононуклеарных клеток, присутствующих в периферической крови.

Следующие два этапа необходимо выполнить максимально осторожно и, безусловно, твердой рукой. Теперь введите ледяной PBS с EDTA трижды через катетер, чтобы промыть нижние дыхательные пути и удалить клетки из альвеолярных пространств. Затем, оснастив шприц объемом 10 мл иглой 20G, проведите перфузию легких 10 мл PBS с гепарином через правый желудочек сердца.

Удаление всех оставшихся клеток крови из сосудов легких считается завершенным, когда легкие становятся белыми. Затем удалите лимфатические узлы средостения, поместив их в отдельную чашку. Чтобы предотвратить гашение флуоресценции, минимизируйте воздействие света на ткань.

Затем вырежьте перфундированные легкие, поместите их в чашку Петри и измельчите с помощью ножниц. После этого подвергните легочную ткань воздействию коллагеназы D в концентрации 250 units/mL при температуре 37 °C. После 25 минут инкубации добавьте в смесь ЭДТА на пять минут, чтобы остановить активность коллагеназы. В завершение пропустите фрагменты переваренных легких через клеточный фильтр с размером пор 100 мкм и проведите лизис эритроцитов с помощью гипотонического буфера.

Аккуратно отделите средостенные лимфатические узлы с помощью тонких игл и подвергните их воздействию коллагеназы, как было показано ранее для легких, после чего профильтруйте ткань через клеточный фильтр после внутрибрюшинного введения, сенсибилизации и воздействия на дыхательные пути. Вал в режиме вызова. Наличие воспалительных клеток можно оценить с помощью окрашивания гематоксилином и эозином репрезентативных срезов легких из контрольной группы.

У животных, получавших физиологический раствор, в тканях отсутствует воспаление, что продемонстрировано на верхнем изображении. Напротив, в срезах легких животных, сенсибилизированных и подвергнутых воздействию Val, повсеместно наблюдаются воспалительные клетки, как показано на нижнем изображении. Для оценки продукции слизи можно использовать окрашивание периодической кислотой-Шиффом, что показано на этом нижнем изображении.

Индукция аллергического воспаления дыхательных путей после введения овальбумина (OVA) сенсибилизированным мышам подтверждается наличием слизи. И наоборот, у контрольной группы мышей, получавших физиологический раствор, наблюдается полное отсутствие выработки слизи, как показано на верхнем графике; после введения OVA дендритные клетки (ДК) легких подвергаются созреванию и последующей миграции в дренирующие лимфатические узлы.

Здесь представлен репрезентативный анализ средопозвоночных лимфатических узлов мыши, который показывает, что у животных, сенсибилизированных и подвергнутых воздействию Val Boomin, обнаруживается умерное, но стабильное увеличение доли CD 11 C-положительных клеток по сравнению с мышами, получавшими физиологический раствор. Кроме того, анализ абсолютного количества CD 11 C-положительных, CD 11 B-положительных и Val Boomin-положительных клеток из средопозвоночных лимфатических узлов у сенсибилизированных и подвергнутых воздействию мышей показывает, что у животных после воздействия происходит многократное увеличение числа DC по сравнению с животными, получавшими физиологический раствор. После просмотра этого видео у нас должно сложиться четкое представление о методе анализа созревания и миграции дендритных клеток легких.

Как только вы полностью освоите эту методику, вы сможете модифицировать ее для оценки ответов дендритных клеток легких на другие патогены, а также на другие экспериментальные факторы.