Анализ легких созревание дендритных клеток и миграции в течение аллергического воспаления дыхательных путей

Целью этой процедуры является оценка созревания и миграции легочных дендритных клеток или ДК во время аллергического воспаления дыхательных путей, вызванного Валь Бумином, у мышей. Это достигается путем предварительной сенсибилизации мышей с помощью Val Boomin, а затем провокационной работы с дыхательными путями с помощью фитси с маркировкой Val Boomin. Затем забор легких и лимфатических узлов средостения.

Наконец, из тканей легких и лимфатических узлов готовят одноклеточную суспензию. В конечном счете, статус созревания и абсолютное количество дендритных клеток по шкале Пулмана, обнаруженных в медиастинальном лимфатическом узле после провокации FITC Val Boomin, могут быть оценены с помощью проточного цитометрического анализа. Этот метод может помочь нам ответить на ключевые вопросы о легочных иммунных реакциях, таких как созревание дендретических клеток, снижение воздействия антигена и их миграция в рейтинговые лимфатические узлы.

И если они все-таки мигрируют, то какова скорость миграции. Начните с добавления свежеприготовленного раствора Val Boomin по каплям в соотношении один к одному в тюбик квасцов во время вортексирования. Перемешивайте смесь в течение 30 минут, а затем наполните одномиллилитровый шприц 0,2 миллилитрами смеси.

Большим пальцем на указательном пальце одной руки возьмитесь за обрывок на шее мыши, который будет введен близко к основанию черепа. Затем введите раствор квасцов Val Boomin в брюшную полость мыши другой рукой. Через семь дней после второй инъекции Val in alwastil подержите в вертикальном положении животное, сенсибилизированное Val in alwastiled, а затем с помощью стерильных наконечников пипетки нанесите пипетку объемом 100 микролитров и свежеприготовленный Val in fxi solution на NAS мыши по каплям.

Начните с прикрепления катетера 20 калибра к одному миллилитру шприца. Затем, подтвердив эвтаназию мыши, откройте грудную полость животного до самой шеи, чтобы обнажить и канюлировать трахею мыши. Крайне важно промывать легкие и профифицировать сердце, чтобы убедиться, что все загрязняющие альвеолярные макрофаги и мононуклеарные клетки, присутствующие в периферической крови, были удалены.

И обязательно выполните эти следующие два шага осторожно и, конечно же, твердой рукой. Теперь введите ледяной PBS с ЭДТА три раза через катетер, чтобы промыть нижние дыхательные пути и удалить клетки из альвеолярных пространств. Затем, после установки шприца объемом 10 миллилитров с иглой 20 калибра, перфузируйте легкие 10 миллилитров PBS, содержащего гепарин, через правый желудочек сердца.

Удаление любых оставшихся клеток крови из сосудистой сети легких считается завершенным, когда легкие становятся белыми. Далее удаляют медиастинальные лимфатические узлы, помещая их в отдельную посуду. Предотвратите гашение прилегания, сводя к минимуму воздействие света на ткань.

Затем препарируйте перфузированные легкие и поместите их в чашку Петри, с помощью ножниц измельчите легкие. Далее переварите легочную ткань при 37 градусах Цельсия в концентрации 250 единиц на миллилитр коллагеназы D. После 25 минут инкубации добавьте в смесь ЭДТА на пять минут, чтобы остановить активность коллагеназы. Наконец, пропустите фрагменты переваренных легких через клеточное сетчатое фильтр размером 100 микрон и проложите эритроциты с гипотоническим буфером.

Раздразните лимфатические узлы средостения с помощью тонких игл и расщепите их коллагеназой, как только что было продемонстрировано для легких, с последующим процеживанием ткани через клеточное сетчатое фильтр после внутрибрюшинной сенсибилизации, сенсибилизации и дыхательных путей. Вэл в вызове. Наличие воспалительных клеток можно оценить с помощью окрашивания гематом, тоином и эозином в репрезентативных срезах легких из контрольной группы.

Животные, обработанные солевым раствором, ткани лишены воспаления, как показано на верхнем графике. Напротив, воспалительные клетки распространены по всем отделам легких от Val у сенсибилизированных и пораженных животных, как это видно на дне. Графическое окрашивание с периодическим сдвигом кислот может быть использовано для оценки выработки слизи, как показано на этом нижнем графике.

Индукция аллергического воспаления дыхательных путей после Val in Challenge у сенсибилизированных мышей подтверждается наличием слизи. И наоборот, полное отсутствие выработки слизи проявляется контролем. Мыши, получавшие физиологический раствор, как показано на верхнем графике после val in Challenge, легочные ДК подвергаются созреванию и последующей миграции в дренирующие лимфатические узлы.

Репрезентативный анализ медиастинальных лимфатических узлов мышей показывает, что небольшое, но последовательное увеличение доли CD-11 С-положительных клеток обнаруживается у животных, сенсибилизированных и зараженных Val Boomin, по сравнению с мышами, получавшими физиологический раствор. Более того, анализ абсолютного количества клеток CD 11 C положительного CD 11 B положительного Val Boomin соответствует C-положительным клеткам из медиастинальных лимфатических узлов Val у сенсибилизированных и пораженных мышей показывает, что в несколько раз большее увеличение числа DC происходит у пораженных мышей по сравнению с животными, получавшими физиологический раствор. После просмотра этого видео мы должны получить действительно хорошее представление о нашей методике анализа созревания и миграции дендритных клеток легочной артерии.

И как только вы действительно поймете эту технику, вы сможете перейти к ее модификации для оценки реакции дендритных клеток легочной артерии на другие патогены, а также на другие экспериментальные факторы.