Планарии иммобилизации, частичное облучение, и тканей

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы поместить популяцию здоровых стволовых клеток, прилегающих к абляционной ткани стволовых клеток, в пределах пароса для анализа поведения стволовых клеток и потомства in vivo во время регенерации. Это достигается путем обезболивания и обездвиживания либо необлученного, либо облученного Leafly пароса для дальнейших манипуляций. Затем иммобилизованный необлученный париан частично экранируется свинцом, а затем подвергается рентгеновскому облучению, в результате чего получается неповрежденный парос с абляционной тканью стволовых клеток, сопоставленной с экранированной тканью, которая остается нагруженной стволовыми клетками.

В качестве альтернативы, тканевый трансплантат, взятый у необлученного донора, может быть пересажен ранее облученному хозяину с целью получения пароса с изолированной популяцией стволовых клеток. Присутствует в стволовой клетке. Получены результаты абляции хозяина, которые показывают выделенные популяции стволовых клеток, прилегающие к абляционным тканям стволовых клеток, путем полной гибридизации РНК in situ two для генов-маркеров стволовых клеток.

Таким образом, описанные здесь методы направлены на лучшее понимание планарий регенерации путем изучения поведения стволовых клеток как в парадигме трансплантации, так и в парадигме частичного облучения, что позволяет нам проверить, влияют ли окружающие ткани и локальная среда, в которой находятся эти стволовые клетки, на поведение этих новых бластов или стволовых клеток. В процессе регенерации, за один-два месяца до эксперимента, подайте плин в соответствии с прилагаемой рукописью. Для того, чтобы получить желаемый размер в этой демонстрации, выбирается плин длиной от одного до двух сантиметров и шириной более двух миллиметров.

Затем их морят голодом за три-семь дней до использования. Затем приготовьте тональный раствор хлора, мягкий местный анестетик, растворив от 0,1 до 0,2% веса на объем клеона в паросской воде. Затем охладите раствор на льду для пересадки тканей с помощью горелки Бунзена, согните капиллярную трубку с внутренним диаметром 0,75 миллиметра под углом один-два сантиметра от конца под углом 90 градусов для разрезания ткани трансплантата.

Затем согните еще одну капиллярную трубку с наружным диаметром 0,7 миллиметра под углом один-два сантиметра от конца под углом 90 градусов для создания отверстия в хосте для приема трансплантата. Далее отрежьте черную фильтровальную бумагу ватманом. Номер три, фильтровальная бумага Кима салфетка и папиросная бумага для самокруток в соответствии с размерами, указанными в сопроводительной рукописи.

После этого приготовьте модифицированный раствор Холта Ферса и насыщенный Кейном раствор Холта Фреттера. Охладите их оба до четырех градусов по Цельсию. Затем приложите сложенную салфетку Ким к квадрату Paraform.

Поместите его на пластину охладителя Пельтье или другое охлаждающее устройство под препарирующим микроскопом. Впоследствии пропитайте салфетку Ким охлажденным раствором Holt Fretter. Затем положите два черных прямоугольника фильтровальной бумаги на салфетку Кима.

Теперь положите лист фильтровальной бумаги Ватмана номер два в чашку Петри. Смочите фильтровальную бумагу раствором Holt Fretter. Затем охладите блюдо на льду для частичного облучения.

Поместите бумажный вкладыш большего размера в большую чашку, как при трансплантации ткани. Смочите фильтровальную бумагу раствором Holt Fretter. Затем охладите блюдо на льду.

Во время этой процедуры заполните чашку Петри охлажденным раствором клеона. Пипеткой Планарии выложите в чашку для пересадки. Анестезируйте только одного хозяина и одного донора за один раз.

При частичном облучении можно обезболить сразу многих животных. Затем дайте париям впитаться в клеоновый раствор на пять-10 минут, пока они не станут неподвижными. Промойте парии, выложив их пипеткой в посуду, наполненную охлажденным раствором Холта Фреттера.

После этого обездвижите область плина, нанеся их пипеткой на черную фильтровальную бумагу, пропитанную охлажденным раствором лада Холта. Затем ориентируйте их вентральной стороной вниз с помощью щипцов. Теперь поместите охлажденную чашку Петри, приготовленную ранее, в ведро со льдом, которое поместится внутри рентгеновского облучателя с верхним источником.

Расположите зону под наркозом в чашке Петри, перемещая черную фильтровальную бумагу. Затем перенесите их на верхний источник рентгеновского облучателя, расположите ведро со льдом таким образом, чтобы расстояние от трубки катода до парии было сведено к минимуму. Тем самым максимизируется мощность эффективной дозы.

Затем расположите свинцовые экраны между парией и катодной трубкой для дозы рентгеновского излучения. Если требуется полная абляция стволовых клеток из неэкранированных областей, введите 30 грей или больше. Сразу после рентгеновского излучения перенесите парос в охлажденную паросическую воду.

После этого дайте паросской воде нагреться до комнатной температуры, а животным освободиться от черной фильтровальной бумаги. Процедура частичного облучения завершена. Чтобы начать эту процедуру под рассекающим микроскопом, расположите зону обезболенного хозяина и донора на отдельных прямоугольных черных фильтрах на салфетке Кима, которая уже охлаждалась на пельтье или охлаждающей пластине.

Используйте капиллярную трубку внутреннего диаметра 0,75 мм, чтобы вырезать пробку трансплантата у донора. Затем с помощью щипцов поместите его на удаленную часть хозяина. Затем с помощью капиллярной трубки с внешним диаметром 0,7 мм извлеките пробку из хозяина.

Впоследствии поместите привой в лунку. Пересадите пересаженную хосту на прямоугольной черной фильтровальной бумаге в подготовленную ранее чашку Петри. Намочите лист рулонной бумаги пропитанным раствором Кейна Холта Фреттера.

Затем поместите его поверх пересаженного хозяина. Затем смочите четыре куска фильтровальной бумаги, оболоченной пропитанным раствором Холтера, и в случае, если пересаженный хозяин впоследствии пропитает четыре пачки разреза, Ким протрите оболочку насыщенным раствором Холта Фреттера. Положите их поверх фильтровальной бумаги.

После этого закрываем крышкой. Поставьте чашку Петри на лед. Затем переложите донорский париан в паросскую воду для восстановления и регенерации.

Когда все пересадки будут завершены, поместите пересаженного париана в инкубатор с температурой 10 градусов Цельсия на ночь. На следующее утро переложите его в чашку Петри, наполненную паросской водой. Дайте паросу либо освободиться от фильтровальной бумаги, либо аккуратно удалите ее щипцами и после этого меняйте воду из пароса один раз в два-три дня.

Гибридизация in situ в облученной, но полностью экранированной контрольной парии, зафиксированная через три дня после облучения, показывает распределение стволовых клеток, неотличимое от такового у парианцев дикого типа. С другой стороны, для пароса, который был лишь частично экранирован, оставляя переднюю и заднюю части тела открытыми, стволовые клетки, по-видимому, удаляются из неэкранированных областей. Здесь показан дорсальный и вентральный виды успешно пересаженного парианца.

Через три дня после трансплантации трансплантат хорошо виден как на дорсальной, так и на вентральной поверхности и окружен характерной непигментированной тканью на границе хозяина трансплантата. Однако при неудачной трансплантации не видно видимой ткани трансплантата в месте трансплантации. Полная гибридизация in situ выявила наличие стволовых клеток только в месте установки трансплантата или вокруг него, что свидетельствует об успешности трансплантации после освоения.

Пересадки могут быть выполнены всего за пять минут каждая. При приближении к 90-100% процентному облучению частичное облучение может быть значительно увеличено. Предполагая, что размер поля вашего облучателя достаточно велик.