В ово Электропорация в Chick мозга для изучения функции генов в развитии дофаминергической Нейрон

В данном эксперименте демонстрируется электропорация среднего мозга куриного эмбриона in ovo для изучения влияния экспрессии экзогенных генов на развитие среднего мозга и дифференцировку дофаминергических нейронов. Сначала в средний мозг эмбрионов курицы на 11-й стадии по Гамбурге-Гамильтону вводится необходимая плазмидная ДНК для специфического направления экзогенной ДНК в развивающийся пузырь среднего мозга. Затем с помощью специально изготовленных малых электродов проводится электропорация пузыря среднего мозга для доставки экзогенной ДНК непосредственно в нейральные предшественники среднего мозга.

Затем соберите эмбрионы 23-й стадии с выраженной экспрессией M cherry в среднем мозге и подготовьте оптимальные поперечные срезы среднего мозга. В конечном итоге анализ иммуноокрашивания на маркеры дофаминергических нейронов, такие как тирозингидроксилаза, может продемонстрировать дифференцировку нейральных предшественников в зрелые дофаминергические нейроны, индуцированную экспрессией интересующих генов. Главным преимуществом данной методики по сравнению с другими существующими методами электропорации in ovo является то, что данный протокол позволяет проводить мембранно-специфическую электропорацию для изучения дифференцировки дофаминергических нейронов.

Хотя этот метод позволяет получить представление о развитии среднего мозга, его также можно применять к другим частям нервной системы для проведения анализа картирования судеб клеток и исследования регуляции экспрессии генов. Чтобы получить эмбрионы курицы стадии 11 по Гамильтону-Хамбургеру, расположите каждое оплодотворенное яйцо на боку и отметьте верхнюю часть штрихом карандаша. Затем поместите лотки на качалку в предварительно прогретый увлажненный инкубатор.

Каждые 24 часа, начиная с 41 часа после оплодотворения, проверяйте влажность и уровень воды. Извлеките икринки из инкубатора и храните их при комнатной температуре. Очистите поверхность каждой икринки 70% ethanol и протрите насухо.

Теперь расположите два кусочка клейкой ленты длиной 4 см рядом друг с другом на яйце, чтобы образовался большой прямоугольник над отметкой карандашом. Плотно прижмите ленту к яйцу, чтобы сформировать окно, используя шприц объемом 10 мл с иглой 18 G. Проколите скорлупу яйца, направляя иглу в сторону от желтка, чтобы не потревожить и не повредить эмбрион.

Отоберите пять миллилитров альбумина из яйца. Протрите иглу 70% ethanol. Высушите иглу перед проколом следующего яйца.

Введите настройки для микропипеточного вытягивателя с горелкой. Затем вытяните тонкостенные капиллярные трубки в инъекционные иглы с помощью пипетки P 10. Наберите от 5 до 10 µL раствора плазмиды в капиллярный наконечник с длинным кончиком.

Затем медленно заполните стеклянную иглу так, чтобы образовался непрерывный столбик жидкости без пузырьков воздуха. Поместите заполненную иглу в держатель, присоединенный к микроманипулятору и микроинъектору. Теперь под диссекционным микроскопом, используя темный фон для лучшей визуализации иглы, обрежьте ее пружинными ножницами в том месте, где заканчивается зеленая жидкость.

Сделайте вырез диаметром от 2 до 2,5 см в месте предыдущего прокола иглой. Это необходимо для извлечения альбумина. Вращайте яйцо в одной руке во время вырезания.

Не забывайте очищать ножницы салфеткой Kimwipe, смоченной в 70% ethanol, после каждого яйца. Перейдите к осмотру эмбриона цыпленка под диссекционным микроскопом. При необходимости визуализируйте эмбрион, вводя 20% India ink в PBS, профильтрованный через мембрану 0,22 µm, под эмбрион цыпленка. Расположите эмбрион параллельно траектории иглы так, чтобы голова была направлена в сторону от иглы.

Медленно проколите нервную трубку под углом 45 градусов в месте соединения среднего и заднего мозга. Начните инъекцию с помощью микроинъектора pico spritzer, установив длительность импульса на 25 milliseconds. Отрегулируйте время в зависимости от среза иглы; заполните плазмидной ДНК, содержащей краситель fast green, только нервный пузырек, представляющий средний мозг.

После извлечения инъекционной иглы нанесите три капли раствора пенициллина-стрептомицина на эмбрион. Проверьте настройки электропоратора B-T-X-E-M-C eight 30 для эффективного проведения электропорации. В области вентральной части среднего мозга расположите небольшие специально изготовленные L-образные платиновые электроды на том же горизонтальном уровне, что и нижняя часть нейральной трубки, так, чтобы эмбриональный средний мозг находился по центру между двумя электродами.

Один раз нажмите на ножную педаль прибора BTX и обратите внимание на пузырьки воздуха, образующиеся вокруг электродов. После каждой успешной электропорации осторожно извлеките электроды из яйца и протрите их. С помощью безворсовой салфетки, смоченной в 70% этаноле, нанесите на эмбрион еще три капли раствора пенициллина и стрептомицина.

Теперь закройте окно кусочком прозрачной упаковочной ленты размером 5 см на 5 см. Плотно загерметизируйте яйцо, не касаясь его содержимого, и поместите яйца обратно в инкубатор с выключенными поворотными устройствами. По достижении нужной стадии перенесите живые эмбрионы в общую чашку Петри, наполненную PBS, для каждого условия.

Затем используйте флуоресцентный диссекционный микроскоп. Проскринируйте собранные эмбрионы на экспрессию m cherry и перенесите положительные эмбрионы в отдельные лунки 24-луночного планшета. Заполните каждую лунку 1 mL свежеприготовленного 2% параформальдегида и инкубируйте в течение трех часов при 4 °C.

Промойте фиксированные эмбрионы в PB S 3 раза, затем поместите их в 15% sucrose до достижения равновесия. Повторите процедуру уравновешивания в 30% sucrose, после чего каждый эмбрион поместите в OCT, ориентируя их надлежащим образом для получения оптимальных поперечных срезов среднего мозга для последующего анализа.

Для последующего анализа в рамках метода электропорации среднего мозга эмбриона цыпленка in ovo подготовьте срезы среднего мозга толщиной 18 мкм с использованием криостата. Эмбрионы цыпленка стадии 11 инъецируют коктейлем плазмид, содержащим флуоресцентный маркер m cherry и интересующие гены, а также краситель Fast Green для отслеживания процесса инъекции. После электропорации среднего мозга эмбрионы подвергаются дальнейшей инкубации, после чего m cherry-положительные эмбрионы извлекают, фиксируют и заливают в парафин.

Затем готовят криосрезы среднего мозга. Образцы эмбрионов цыплят, в которых инъекция и электропорация прошли успешно, анализируют с помощью иммуноокрашивания с использованием маркеров среднего мозга, таких как тирозингидроксилаза. Экспрессия m cherry обычно становится заметной в области среднего мозга после дальнейшего развития, при этом экспрессия m cherry служит маркером инъекции.

Эмбрионы с надлежащей экспрессией m cherry затем фиксируют, заливают в среду и ориентируют для подготовки крио срезов среднего мозга. В данном случае спецификация дофаминергической судьбы в электропорированных нейральных прогениторах исследуется путем анализа колокализации m cherry и гена с flag-меткой с маркером дофаминергических нейронов тирозингидроксилазой. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как регионально ограничить экспрессию гена в прогениторах дофаминергических нейронов эмбрионального среднего мозга, включая методы инъекции ДНК-конструктов конкретно в область среднего мозга и способы точного проведения электропорации с использованием небольших изготовленных на заказ электродов в соответствии с данной процедурой.

Для изучения функции генов и генной регуляции в специфических областях и типах клеток нервной системы могут быть использованы другие методы, такие как RNI-опосредованный нокдаун или экспрессия энхансеров, связанных с репортерными генами.