Подготовка T фактор роста клеток от Крыса Спленоциты

Здравствуйте, меня зовут Кристин Битон. Я работаю ассистентом научного сотрудника в лаборатории Джорджа Чена на кафедре физиологии и биофизики Калифорнийского университета в Ирвине. И в ближайшие два дня я покажу вам, как приготовить TCGF, что означает фактор роста Т-клеток.

Таким образом, для нашей повседневной клеточной культуры, когда нам не нужно точное знание состава цитокинов в питательной среде, мы используем фактор роста Т-клеток, который является S-супернатантом из культуры spl CY, содержащим цитокины, необходимые для помощи Т-клеткам в росте. Итак, мы готовим TCGF следующим образом: когда мы убиваем здоровых крыс Луиса, берем у них селезенку, готовим суспензию одиночных клеток, избавляемся от красных кровяных телец, а затем мононуклеарные клетки мы стимулируем с помощью con carnaval in, что побуждает Т-клетки производить все необходимые цитокины для их роста. Чтобы создать TCGF, нам нужно активировать клетки.

добавить лектин conval в сокращенно corona A в нашу клеточную культуру. Поэтому, когда мы добавляем conc in a в нашу клеточную культуру, он связывается с гликозилированным Т-клеточным рецепторным комплексом и связывается с несколькими комплексами одновременно, он делает то, что мы называем кэппингом. Таким образом, он будет агрегировать, создавать кластер всех рецепторов на поверхности клетки, и это вызовет сигнал активации в Т-лимфоцитах.

Так что после того, как клетки активируются, они взрываются. Таким образом, они будут увеличиваться, а затем начнут выделять цитокины. Первоначально мы думали, что TCGF в основном состоит из интерлейкина-2, но теперь мы знаем, что это не совсем так.

Он также содержит интерферон, гамма, ФНО, альфа и, вероятно, также цитокины в очень малых количествах, которые просто необходимы для поддержания жизни клеток после 48 часов. Итак, мы собираемся удалить клетки, и когда мы удалим клетки, и у нас останется только надосадочная жидкость, у нас все еще останется немного свободного конала в снате. И это будет проблемой, потому что мы действительно хотим использовать наш фактор роста Т-клеток для поддержания роста Т-клеточных линий.

И если мы оставим конвал в свободном месте, он активирует клетки, когда мы не хотим, чтобы они активировались. Поэтому, чтобы обойти эту проблему, мы добавим избыток сахара, который будет связываться со всеми свободными консиделками в организме. Таким образом, он будет полностью инактивирован и не будет связываться с другими гликозилированными рецепторами на клетках, когда мы добавляем TCGF в культуру.

Итак, приступим. Первым шагом для этого эксперимента является извлечение селезенки у крысы сразу после эвтаназии. Так что это то, что я собираюсь сделать прямо сейчас, используя стерильные инструменты.

И как только я вытащу селезенку, я собираюсь ввести ее в PBS с добавлением антибиотиков, а в качестве антибиотиков я использую пенициллин и стрептомицин. Итак, приступим. Поэтому я распыляю на крысу 70% этанола, чтобы убедиться, что у меня нет большого загрязнения моей культуры.

А затем, используя свои инструменты, я собираюсь сделать небольшой надрез на коже здесь. Затем я удаляю слой мышц и селезенка появляется прямо здесь. Поэтому я беру другой пинцет, аккуратно вытаскиваю селезенку, не повреждая ее.

Я удаляю соединительную соединительную ткань следующим образом. Так что теперь у меня есть селезенка. Конечно, я очень осторожен, чтобы не повредить что-либо еще внутри брюшной полости, потому что любое повреждение кишечника приведет к немедленному заражению моей селезенки.

А затем я собираюсь перенести селезенку в пробирку, содержащую PBS плюс антибиотики. И эту трубочку я держу на льду. Итак, я собрал селезенку у трех крыс.

Итак, мы готовы приступить к приготовлению одноклеточной суспензии из этой селезенки. Итак, теперь, когда у меня есть селезенки, я принес их в культуру тканей, чтобы приготовить из них одноклеточную суспензию с помощью 70-микронных клеточных тренажеров. Итак, мне понадобится несколько вещей, чтобы сделать одноклеточную суспензию из селезенки.

Мне нужны стерильные инструменты, одна пара щипцов и одна пара ножниц. Затем у меня есть поршень стерильного шприца на один миль в чашке Петри. Я собираюсь ввести селезенку в PBS плюс антибиотики.

И в другую чашку Петри я поместил 70-микронный клеточный фильтр в 10 миллилитров PBS плюс антибиотики. Итак, первый шаг - убедиться, что селезенка чистая, потому что, как вы можете видеть здесь, все еще есть маленькие кусочки соединительной ткани, и я собираюсь удалить их, потому что они очень быстро засоряют клеточное ситечко. Поэтому для этого я просто отрезаю то, что мне не нужно, и выбрасываю это в крышку чашки Петри.

Итак, теперь моя селезенка в основном чистая, поэтому я собираюсь взять селезенку одну за другой, поместить их в камеру и нарезать небольшими кусочками. Следующим шагом будет изготовление одноклеточной суспензии. Так что, конечно, поскольку я хочу все как есть, я вообще не прикасаюсь к клеточному тренажеру и использую поршень стерильного одномильного шприца, чтобы продавливать кусочки селезенки через клеточный тренажер.

И, как вы можете видеть на внешней стороне клеточного тренажера, я делаю одноклеточную суспензию. Так что в первый раз у меня все еще есть небольшие кусочки селезенки, но я уже собираюсь удалить одноклеточную суспензию. У меня уже есть переложить его в трубку на 50 мил, которую я хранил на льду.

И я собираюсь пополнить свой клеточный фильтр еще 10 милами PBS и антибиотиков. Так что я принимаю еще 10 мил моего PBS с антибиотиками приблизительно, не обязательно очень точно 10 минут, мы просто умываемся. Я помещаю его в ситечко и затем использую ту же процедуру.

Я возвращаюсь к поршню шприца и надавливаю на него еще немного. Конечно, вы никогда не сможете пройти через все, потому что есть соединительная ткань и маленькие кусочки жира, которые я не смог удалить, но которые останутся в клеточном фильтре. Но вы должны получить большую часть селезенки для клеточного фильтра.

И далее я повторяю в точности то, что делал ранее. Я собираюсь собрать свою одноклеточную суспензию и добавить ее к тому же зубу. К настоящему времени в камерном скринере почти ничего не осталось от экрана, и PBS, который выходит, намного четче. И я собираюсь просто промыть еще раз, и мы уже должны вытащить большую часть клеток.

Итак, теперь у меня есть одноклеточная суспензия цитов PLE, и я собираюсь вращать их вниз, просто чтобы придать им палитру. Так что вращения в течение восьми-10 минут будет достаточно. Итак, теперь мы раскрутили наши PLE-циты, и у нас есть хорошая палитра.

Итак, что я собираюсь сделать, так это избавиться от надосадочной жидкости, а затем я собираюсь удалить эритроциты. Итак, я собираюсь суспензировать миоциты и использовать хлорид аммония. Итак, это СУ, раствор хлорида аммония 15 моляров, и я собираюсь использовать пять миллилитров на селезенку.

Так как у меня было три селезенки, я собираюсь использовать 15 миллилитров хлорида аммония, и я собираюсь делать это на льду. Итак, чтобы эритроциты располагались, я собираюсь осторожно проводить их вверх и вниз в течение трех минут. Хорошо, мы будем использовать этот дубль с более высокой экспозицией здесь.

Итак, я анализировал электроциты в течение трех минут. Я собираюсь заполнить свою трубку PBS, или вы также можете использовать среду. Это необходимо для того, чтобы вернуть осмолярность раствора к нормальному для клеток диапазону.

И я собираюсь вращать ячейки, как я делал ранее, в течение восьми-десяти минут, чтобы гранулировать их. А потом я их дважды помою с помощью того же PBS с антибиотиками. Итак, теперь мы охватываем клетки после обработки электроцитов и не беспокойтесь, мы никогда не получим стопроцентного высвобождения электроцитов.

Так что поддон все равно будет красным, но надосадочная жидкость будет более прозрачной. И теперь я собираюсь опорожнить надосадочную жидкость, разбить поддон, добавить немного PBS до 50 мил, уменьшить и повторить этот шаг еще раз, чтобы у меня было две стирки. Я дважды промыл миоциты, а затем суспендировал их в культуральной среде и подсчитал с помощью вашего цитометра.

Как и ожидалось. Из трех селезенок я получил около 600 миллионов клеток, что вполне ожидаемо, поскольку одна селезенка обычно дает нам от 200 до 250 миллионов клеток. Итак, что я собираюсь сделать сейчас, так это засеять свои клетки по 2 миллиона на мельницу в моей среде, которая была дополнена 10% фетальной сывороткой.

И в эту среду я собираюсь добавить два микрограмма на миллер conc A для стимуляции клеток. И после этого я просто собираюсь поместить клетки в инкубатор на 48 часов. Клетки находятся в инкубаторе уже 48 часов, и, как я покажу вам, они выросли довольно хорошо.

Среда стала оранжевой. Итак, теперь мы готовы закончить нашу подготовку к TCGF. Как вы помните, я добавлял con carnaval в свою клеточную суспензию для активации клеток.

Таким образом, конкарнавал в a — это лектин. Он свяжет сахара на всех рецепторах Т-клеток и искусственно активирует все эти клетки. Проблема, с которой мы имеем дело сейчас, заключается в том, что у нас все еще есть некоторая часть конкарнавала в супернатанте клетки S.

И поскольку мы собираемся использовать snat в других культурах Т-клеток для расширения клеток, мы не хотим, чтобы карнавал присутствовал в этих клеточных культурах. Итак, чтобы избавиться от него, я собираюсь добавить избыток сахара, с которым связывается con naval in a bind, и это метил-альфа D-цитар, показанный здесь. И я собираюсь добавить избыток этого сахара, полностью растворить его.

И как только это будет сделано, я собираюсь стерильно отфильтровать мои клеточные надосадочные жидкости и заморозить жидкости Али для использования в течение следующих нескольких недель или месяцев. Итак, давайте начнем с этого последнего шага. Поэтому я добавляю надосадочную жидкость для клеточных культур в 50 мил пробирки, чтобы иметь возможность вращать их, чтобы избавиться от клеток.

Так что я просто заполняю столько тюбиков, сколько нужно, и я не делаю этого в культурном колпаке, я мог бы, но поскольку мне нужен любой способ фильтровать мой раствор в конечном итоге, потому что я добавляю сахар, который не стерилен, я просто делаю это на столе. Так проще. Теперь я залил все свои клетки и надосадочную жидкость в свои соколиные пробирки на 50 мил.

Итак, я собираюсь поднести их к центрифуге и вращать около 10 минут. И единственная причина, по которой я их вращаю, заключается в том, чтобы гранулировать клетки так, чтобы у меня были прозрачные надосадочные пласты. Теперь ячейки были разделены вниз, так что надосадочная жидкость чистая, и это то, что я хотел собрать.

Итак, я собираюсь собрать всю надосадочную жидкость в чистую колбу площадью 150 квадратных сантиметров. И в эту колбу я собираюсь добавить сахар. Поэтому, пока клетки вращались вниз, я взвесил достаточно сахара, чтобы добавить 15 миллиграммов на мл надосадочной жидкости.

Я собираюсь полностью дать ему раствориться, а после этого я собираюсь стерильно отфильтровать мою надосадочную жидкость. Итак, теперь я добавлю сахар 15 миллиграмм на мл надосадочной жидкости. Я ставлю крышку обратно, и, поскольку я не работаю в стерильных условиях, не имеет значения, попадает ли еда в крышку, поэтому я перемешиваю, пока весь сахар не растворится.

Это должно быть довольно быстро. Да, теперь весь сахар растворен. Так что все, что мне нужно сделать, это стерильный фильтр надосадочной жидкости, а затем я собираюсь его аликвотировать.

Поэтому обычно я делаю аликвоты от 10 до 15 мил, которые храню при температуре минус 20 градусов. Такие аликвоты могут храниться несколько месяцев. Вы также можете хранить TCGF в холодильнике, но тогда я бы использовал его в течение следующих 10-15 дней.

В течение последних двух дней я показал вам, как получить фактор роста Т-клеток, и этот надосадочный продукт очень прост в изготовлении и очень дешев в приготовлении. Поэтому мы очень часто используем его в лаборатории для поддержания наших Т-клеточных линий в культуре без необходимости покупать дорогие коктейли цитокинов. Так что удачи в ваших экспериментах.