Генерация увековечен мышиного мозга микрососудистой эндотелиальной клеточной линии, как

Общая цель данной процедуры заключается в получении гомогенизированной культуры бессмертных эндотелиальных клеток головного мозга. Для этого сначала проводят выделение головного мозга новорожденных мышей и получение суспензии одиночных клеток. На втором этапе осуществляется иммортализация клеток с помощью среднего Т-антигена полиомавируса.

Затем клетки выращивают в течение примерно четырех недель до образования гомогенного эндотелиального монослоя. Заключительным этапом является характеристика новой клеточной линии с помощью таких методов, как иммуноокрашивание, вестерн-блоттинг и Q-Q-P-C-R. Значение данной методики распространяется на терапию нейровоспалительных или ишемических заболеваний головного мозга, поскольку она позволяет проводить доклиническую оценку терапии и получать данные о патофизиологии.

Процедуру продемонстрирует доктор Элейн Сальвадор, постдок из моей лаборатории. После извлечения мозга новорожденного мыша в возрасте от трех до пяти дней и его переноса в чашку Петри с буфером А, для каждой подготовки потребуется мозг пяти-десяти мышей; работу следует проводить в ламинарном шкафу. Из каждого мозга удалите мозжечок, ствол мозга, мозговые оболочки и фрагменты капилляров.

Затем перенесите полушария головного мозга во вторую чашку Петри, содержащую буфер A. С помощью стерильного скальпеля разрежьте полушария на мелкие кусочки, затем с помощью 10-миллилитровой пипетки многократно аспирируйте и выталкивайте ткань с буфером до полного исчезновения комочков. После этого перенесите суспензию в 50-миллилитровую центрифужную пробирку и центрифугируйте ткань мозга при 250 ×g в течение пяти минут при комнатной температуре. Удалите супернатант и растворите осадок в 4,5 миллилитрах буфера A с добавлением 1,5 миллилитров 0,75% w/v.

Добавьте коллагеназу. Инкубируйте ткань в растворе коллагеназы в течение 45 минут в водяной бане при 37 °C, периодически перемешивая. Тем временем подготовьте планшеты для культивирования тканей, покрыв четыре лунки 12-луночного планшета стерильным раствором в концентрации 0.1 mg/mL.

Коллаген и 50 мМ уксусная кислота позволяют коллагену прикрепиться к лункам при комнатной температуре в течение одного часа. По истечении 45-минутного периода инкубации остановите переваривание ткани мозга, добавив 15 мл буфера А, и тщательно ресуспендируйте осадок в этом растворе. Затем центрифугируйте при 250 ×g в течение 10 минут и удалите супернатант.

Затем, чтобы удалить миелин из препарата, добавьте к ткани 10 миллилитров стерильного 25% (масса/объем) раствора B, s, A и PBS и центрифугируйте при 1000 ×g в течение 20 минут при температуре четырех градусов Цельсия. После центрифугирования осторожно удалите супернатант, затем растворите осадок в 15 миллилитрах буфера A и перенесите в новую центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров; повторно центрифугируйте при 250 ×g в течение пяти минут при комнатной температуре. Тем временем дважды промойте планшет с покрытием из коллагена IV с помощью PBS.

После второй промывки оставьте две лунки пустыми, а в две другие добавьте по два миллилитра ростовой среды. После удаления супернатанта ресуспендируйте осадок клеток, состоящий преимущественно из эндотелиальных клеток, в четырех миллилитрах ростовой среды, содержащей пуромицин в концентрации четыре микрограмма на миллилитр, и перенесите по два миллилитра клеточной суспензии в каждую из двух пустых лунок, покрытых коллагеном; инкубируйте при 37 °C в течение 45 минут для уничтожения быстро адгезирующих неэндотелиальных клеток. Затем аспирируйте ростовую среду из двух лунок, не содержащих клеток, и удалите ее.

Затем перенесите среду, содержащую неадгезивные клетки, включая фракцию эндотелиальных клеток, в эти две лунки. Добавьте по два миллилитра свежей среды в предыдущие лунки. В этих лунках содержатся другие типы клеток, такие как фибробласты и астроциты; их можно культивировать параллельно и использовать для сравнения морфологии.

Инкубируйте клетки в инкубаторе для культур тканей в течение ночи. На следующий день замените среду на свежую. Культивируйте фибробласты GPE neo, которые секретируют репликативно-дефицитный вирус с онкогеном Polyoma middle T, в колбах с желатиновым покрытием, содержащих среду для GPE neo. Трансфекция онкогеном Polyoma middle T обеспечивает преимущество в росте эндотелиальных клеток над неэндотелиальными, что приводит к формированию гомогенного монослоя клеток с эндотелиальной морфологией. После четырех-шести недель культивирования. Клетки GPE neo недоступны в коммерческой продаже и могут быть получены в качестве общих общественных материалов.

После культивирования клеток GPE Neo Fiberblast в течение 24 часов удалите 10 мл среды и добавьте стерильный раствор poly brain до конечной концентрации 8 мкг/мл. Пропустите полученную смесь супернатанта через фильтр с порами 0,45 мкм для удаления клеточных фрагментов. Затем аспирируйте среду из культур эндотелиальных клеток и после инкубации в течение ночи добавьте в лунки по 2 мл смеси супернатанта с poly brain.

Повторите эту процедуру на следующий день, используя свежую аликвоту смеси супернатанта и полимеризованного мозга. Удалите смесь супернатанта и полимеризованного мозга. Промойте клетки дважды с помощью PBS, а затем добавьте свежую ростовая среда.

Продолжайте заменять питательную среду каждые три дня. Когда клетки достигают конфлюэнтности, перенесите их (1–2 пассажа) на планшеты, покрытые коллагеном IV. Стабильные линии церебральных эндотелиальных клеток обычно получают через четыре-пять недель последующего культивирования.

Дождитесь формирования гомогенного эндотелиального монослоя по всей площади лунки. После получения стабильных клеточных линий перенесите их в культуральные флаконы, покрытые коллагеном IV типа; пассируйте клетки не чаще одного раза в неделю, используя 3 mL трипсина-ЭДТА и инкубацию при 37 °C в течение 5–15 минут до полного разобщения клеточного слоя. После добавления 5 mL среды посейте клетки в новые флаконы, избегая превышения коэффициента расщепления более чем 1:4.

Когда количество клеток станет достаточным для получения конфлюэнтного флакона T 75, можно подготовить криопорции клеток для последующего использования. Для этого соберите клетки с помощью трипсина, как описано ранее, затем центрифугируйте клеточную суспензию при 250 ×g в течение пяти минут. При комнатной температуре ресуспендируйте клеточный осадок в шести миллилитрах среды для замораживания, затем перенесите по 1.5 мл клеточной суспензии в четыре криопробирки.

Поместите криопробирки в контейнер для замораживания Nalgene, заполненный изопропанолом, и выдержите их в течение одного дня при температуре -80 °C. В завершение храните криопробирки в жидком азоте. Разморозьте криоконтейнер с клетками на водяной бане, а затем перенесите их в центрифужную пробирку объемом 15 мл, содержащую 10 мл питательной среды.

Предварительно прогрейте среду до 37 °C и центрифугируйте пробирку при 250 ×g в течение пяти минут при комнатной температуре. После аспирации среды ресуспендируйте осадок в соответствующем объеме ростовой среды. Перенесите клеточную суспензию в культуральный флакон T 25, покрытый коллагеном IV, с предварительно прогретой ростовой средой.

Плотность клеток для посева должна составлять не менее 1 × 10⁴ клеток на мл. На следующий день замените среду и продолжайте пассировать клетки, как и прежде; когда через пять дней клетки достигнут конфлюэнтности, посейте их с плотностью, необходимой для ваших последующих экспериментов. Характеристика клеток C end проводилась методом иммуноокрашивания на маркеры эндотелия и гематоэнцефалического барьера.

На этом изображении показана морфология клеток C and, иммуноокрашенных на clain five. Клетки C and имеют морфологию, сходную с первичными культурами ЭЦК головного мозга, с монослоями плотно упакованных удлиненных клеток, у которых наблюдалось ингибирование роста. При полной конфлюэнтности клетки экспрессировали детектируемые уровни clain.

Здесь клетки C CN были иммуноокрашены антителом к окклюдину. Здесь мы видим экспрессию белков VE-кадгерина, которые локализованы в межклеточных контактах, что также показано методом иммунофлуоресцентного окрашивания. Трансэндотелиальное электрическое сопротивление измеряли с помощью установки, содержащей электроды для пропускания тока и измерения напряжения.

На этом рисунке видно, что трансэндотелиальное электрическое сопротивление клеток C end увеличивается со временем культивирования после их развития. Данный метод открыл исследователям в области нейробиологии путь к изучению цереброваскулярных нарушений на мышиной модели.