Выделение Рибосома связанных стадии становления Полипептиды

Общая цель данной процедуры — идентификация и локализация основных сайтов трансляционного стопа для мРНК, транслируемой в бесклеточной системе трансляции. Это достигается путем первоначального клонирования интересующего гена под контроль транскрипционного промотора T7. Затем проводится транскрипция и очистка мРНК.

Затем проводят трансляцию in vitro в присутствии мРНК и радиоактивных аминокислот для мечения синтезируемого белка и растущих полипептидных цепей. Наконец, полисомы выделяют методом центрифугирования по скоростям седиментации, а выделенные растущие цепи разделяют с помощью гель-электрофореза. В итоге можно получить результаты, демонстрирующие растущие полипептиды различной длины при использовании SDS-PAGE с буфером Тристин и авторадиографии, что указывает на наличие сайтов паузы вдоль исследуемой мРНК.

Основное преимущество данного метода по сравнению с нашими существующими методами, такими как анализ защиты ядер микрококаль, заключается в том, что он чрезвычайно прост, быстр и эффективен, а также позволяет определять и идентифицировать основные сайты трансляции вдоль любой мРНК в заданной клеточной системе. Этот метод может помочь ответить на некоторые ключевые вопросы в области трансляции и ко-трансляционного фолдинга белков, например, как такие факторы, как использование кодонов, содержание мРНК и/или вторичная структура мРНК, могут влиять на кинетику трансляции. Данный метод может в дальнейшем способствовать пониманию взаимосвязей между кинетикой трансляции и ключевыми этапами пути ко-трансляционного фолдинга белков.

Значимость данного метода заключается в понимании процесса фолдинга белков in vivo, который, как полагают, в значительной степени происходит котрансляционно во время трансляции на рибосоме, хотя в настоящем исследовании используется бесклеточная трансляция гамма-кристаллина с применением коммерчески доступного клеточного экстракта. Данный метод также может быть применен для идентификации трансляционных IDE в потенциально любом белке с использованием трансляционно-компетентного экстракта, приготовленного из любого клеточного источника. Как правило, специалисты, впервые использующие этот метод, могут столкнуться с трудностями на двух ключевых этапах протокола.

Первым этапом является определение общего времени, необходимого для проведения реакции трансляции, чтобы обеспечить связывание большинства синтезируемых полипептидов с рибосомой. Вторым этапом является подбор подходящей системы разделения для выделения основной массы синтезируемых полипептидов; выбор системы разделения зависит от размера изучаемого белка. Идея этого метода впервые возникла у нас, когда в середине восьмидесятых годов мы решили изучить кинетику трансляции молекул глобина в контексте предлагаемой модели котрансляционного фолдинга глобина.

Неравномерность трансляции глобина была впервые отмечена Pro и Maurice в 1974 году при использовании размерно-исключающей хроматографии глобиновых цепей NAS. Однако их анализ не обладал достаточной точностью; Pro и Maurice наблюдали четыре основных сайта паузы во время трансляции глобина. Впоследствии наш анализ позволил выявить около 10 дополнительных сайтов паузы и построить детальную модель трансляционного фолдинга глобина. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как описанная здесь методика включает выделение полисом и анализ синтезируемого полипептида с помощью SDS-PAGE геля.

Оба этих этапа имеют решающее значение для получения высококачественных и воспроизводимых результатов. Демонстрацию протокола проведет аспирант лаборатории Myelo Sujata. Для транскрипции матричной РНК in vitro начните с интересующего гена, который был клонирован под промотором T7 и/или SP6; используя подходящий рестриктазу, линеаризуйте матрицу ДНК ниже стоп-кодона и/или на 3'-конце мРНК.

Образец рестрикционного переваривания подвергают гель-электрофорезу для подтверждения полной линеаризации ДНК. После определения оптимальной концентрации матрицы ДНК используют набор для транскрипции для синтеза матричной РНК in vitro в соответствии с инструкциями производителя. Затем для очистки мРНК применяют осаждение литийхлоридом.

Затем используйте электрофорез в акриламидном или агарозном геле для проверки чистоты образца. Подготовьте реакционную смесь для трансляции in vitro объемом 100 µL в воде, свободной от нуклеаз, добавив смесь аминокислот с концентрацией 1 мМ (без метионина), 10 ед. ингибитора РНК, 20 мкКи радиоактивного 35 S метионина и лизат ретикулоцитов кролика. Затем предварительно прогрейте реакционную смесь, инкубируя ее при 30 °C в течение пяти минут.

Затем добавьте 2 µg мРНК и инкубируйте при 30 °C в течение пяти минут для остановки реакции, после чего поместите смесь на лед для изоляции новосинтезированных полипептидов, связанных с рибосомами. Наслоите реакционную смесь для трансляции на 4,5 mL 30% глицерина в Tris-HCl буфере с pH 7,6, содержащем KCl и MgCl₂, и центрифугируйте с использованием ротора TLA 110 при 100 000 ×g в течение одного часа при 4 °C. Затем осторожно удалите супернатант и ресуспендируйте полисомальный осадок, содержащий новосинтезированные полипептиды, в небольшом объеме 1 mM Tris-HCl буфера с pH 7,6, содержащего 0,5 mg/mL рибонуклеазы A, и инкубируйте в течение 30 минут при 37 °C.

Для усиления гидролиза пептидной связи TRNA Esther добавьте в реакционную смесь гидроксид натрия до конечной концентрации 10 millimolar и инкубируйте ее еще в течение 30 минут. Разделите синтезируемые полипептиды с помощью электрофореза в ПААГ в системе tris-tris SDS, затем зафиксируйте и высушите гели. Подвергните гели авторадиографии с последующим фосфоримиджингом для детекции синтезируемых полипептидов.

Изменение движения рибосом, вызванное изменениями в пуле тРНК, должно привести к изменениям в распределении размеров синтезируемых полипептидов, накапливающихся в ходе трансляции, а также к изменению их относительной интенсивности, что отражает длительность паузы в данной точке. Начинающие синтезироваться полипептиды гамма-B-кристаллина были выделены и разделены методом электрофореза в ПААГ с SDS в буфере Тристин. Различная длина и интенсивность полипептидов в системах RRL и e coli указывают на то, что движение рибосом вдоль мРНК в этих двух системах характеризуется разной кинетикой трансляции.

Например, обратите внимание на выраженную полосу 17,7 килодальтон в лизате e coli, которая отсутствует в системе лизата ретикулоцитов кролика. Кристаллическая Gamma B содержит тандемные кодоны аргинина, которые часто встречаются в системах млекопитающих, но известны как крайне редкие и медленно транслируемые в e coli, что позволяет предположить, что данная полоса вызвана паузой рибосомы на этих тандемных редких кодонах, как показано здесь.

В отсутствие мРНК полосы не наблюдаются, а обработка пуромицином удаляет большинство растущих цепей из полисом. Кроме того, длительная обработка пуромицином удаляет все растущие цепи, что подтверждает, что наблюдаемые полипептидные продукты являются рибосом-ассоциированными растущими цепями, а не MRP, коседиментирующими с полисомами. После освоения эта методика может быть выполнена за один-два дня. Продолжительность процедуры в основном зависит от времени центрифугирования и этапа электрофореза растущих пептидов в геле.

При выполнении данной процедуры важно немедленно остановить реакцию трансляции по истечении времени инкубации. Чтобы предотвратить высвобождение растущего полипептида из рибосомы, критически важно избегать попадания РНК на любом этапе. Загрязнение РНК может повлиять на эффективность трансляции экстракта и привести к высвобождению растущего полипептида из рибосомы в ходе данной процедуры.

После разработки данного метода можно будет изучать и другие цели, например, влияние белков, связывающихся с мРНК, на эффективность движения рибосомы по конкретному сообщению. Этот метод открыл исследователям в области фолдинга белков возможность изучить роль пауз трансляции, вызванных наличием редких кодонов, в процессе трансляционного фолдинга белков. Ранее этот метод применялся для изучения влияния замен кодонов на движение рибосомы по сообщению и на трансляционный фолдинг белков.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как идентифицировать сайты трансляционной активности представленной мРНК путем выделения нативных полипептидов, связанных с рибосомой. Не забывайте, что работа с радиоактивными изотопами и мечеными аминокислотами, такими как, например, ³⁵S-метионин, требует особых мер предосторожности, которые всегда должны учитываться при выполнении данной процедуры.