Affinity очистки вируса гриппа рибонуклеопротеидных комплексов с хроматина инфицированных клеток

Ликонегативная цепь, РНК вирусов. Геном вирусов гриппа упакован в виде ядерных белковых комплексов вирусных ребер, или VR nps, в которых одноцепочечный геном инкапсулирован ядерным белком и связан с полимеразным комплексом куркумы, состоящим из PA PB one и PB двух субъединиц для очистки интактных комплексов из инфицированных клеток млекопитающих. Клетки Hela инкубируются с рекомбинантным стрепт-меченым вирусом гриппа.

Как только вирус проникает в клетки, вирусная РНК синтезируется в ядрах после заражения, клетки подвергаются воздействию детергента и фракционируются на цитоплазматические ядерные и хроматиновые фракции с использованием центрифугирования и протокола хроматиновой фракции на основе атаки. Наконец, стрепток-меченые VRP аффинно очищены от каждой фракции Анализ белкового и РНК-состава очищенных VR NPS путем окрашивания серебром демонстрирует, что при использовании этого протокола даже в тесном контакте можно выделить связанные хроматин VRP. Целый. Таким образом, одним из основных преимуществ нашего протокола по сравнению со стандартными методами аффинного очищения ядерных белковых комплексов вируса гриппа является то, что с помощью нашего метода можно очистить VR NPS от хроматина инфицированных клеток, который, как известно, является местом синтеза мРНК вируса гриппа.

Таким образом, наш метод может быть использован для ответа на вопросы, связанные с регуляцией репликации и транскрипции вируса, такие как, например, какие вирусные или клеточные факторы, а также какие посттрансляционные модификации необходимы, например, для синтеза вирусной мРНК или синтеза вирусной геномной РНК. Таким образом, исследователи, не знакомые с этим методом, могут столкнуться с некоторыми трудностями, потому что субядерное фракционирование очень чувствительно к биохимическим условиям, а также может сильно различаться между различными клеточными линиями. Начните этот протокол с лечения наших клеток, которые были инфицированы вирусом гриппа, RWSN PB two strep, который имеет стрептококковую метку, генетически сросшую с С-концом субъединицы PB two при кратности инфекции трех.

Вымойте клетки один раз холодным ПБС, затем добавьте 12 миллилитров холодного ПБС и уберите их из посуды. С помощью резинового скребка. Переложите ячейки в коническую пробирку объемом 50 миллилитров и гранулируйте их центрифугированием.

Самым сложным аспектом этой процедуры является протокол фракционирования клеток. Ядра клеток очень чувствительны к процедурам гомогенизации и смешивания, и если их провести неправильно, это может легко испортить экстракт хроматина. Поэтому очень важно следовать не только методам гомогенизации, но и общему обращению с лизатами, как мы показываем здесь.

Вслед за спиновым аспиратом, PBS и Resus, суспендируйте клеточную гранулу в 10 миллилитрах холодного сахарозного буфера. Прикрепите наконечник для дозатора объемом 200 микролитров к пластиковой пипетке для сыворотки объемом 10 миллилитров и пропустите через него клетки, чтобы разбить клеточные комки. Выдержать суспензию на льду в течение 10 минут.

Периодически аккуратно переворачивая клетки, чтобы снова суспендировать их. Затем добавьте не-IET P 40 до конечной концентрации 0,5% и сделайте вихревой на высокой скорости в течение 15 секунд, немедленно центрифугируйте в течение 10 минут при 3,500 умноженных на G при четырех градусах Цельсия в настольной центрифуге. После отжима извлеките супинат и переложите его в 15 миллилитровую коническую трубку.

Хранить супинат при температуре четыре градуса Цельсия. Это цитоплазматическая фракция. Гранула должна быть меньше и белее, чем исходная клеточная гранула, как показано здесь.

Если протокол будет завершен позже, храните клеточную гранулу при температуре четыре градуса Цельсия. В противном случае продолжайте промывать гранулу в пяти миллилитрах холодной сахарозы, буферизовать и центрифугировать, как и раньше. Как только спин завершится, выбросьте супинат и снова суспендируйте гранулу, которая содержит ядра в 1,5 миллилитрах холодного буфера для ядерной плазменной экстракции.

Переложите ресуспендированную гранулу в охлажденный четырехмиллилитровый танцевальный гомогенизатор с плотно прилегающим пестиком и гомогенизируйте ядра за 20 ударов. Избегая пенообразования, сопротивление должно увеличиваться примерно после 10 ударов. Чтобы убедиться в эффективности гомогенизации, исследуйте образец под фазово-контрастным микроскопом.

Ядра уже не должны быть круглыми, а иметь неправильную форму и выглядеть так, как будто они лопнули. После того, как ядра будут гомогенизированы, перенесите их в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Инкубируйте гомогенат на вращающемся колесе при температуре четыре градуса Цельсия в течение 20 минут.

Затем центрифугируйте при 16 000 G в микроцентрифуге в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. После спина перенесите супинат, который является ядерной плазменной фракцией, в пробирку объемом 1,5 миллилитра, и храните ее при температуре четыре градуса Цельсия. Затем Риз суспендирует гранулы в 1,5 миллилитрах сбраживания, буфер предварительно подогреть до 37 градусов по Цельсию.

Затем инкубируйте фракцию в течение 10 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Далее добавьте 42 микролитра пяти моляров хлорида натрия, чтобы довести концентрацию хлорида натрия до 150 миллимоляров, затем инкубируйте в течение 20 минут на льду. Центрифугируйте при 16 000 раз, G в микроцентрифуге при температуре четыре градуса Цельсия в течение 10 минут.

После отжима снимите супинат и храните его при температуре четыре градуса Цельсия. Это CH one 50 фракции. Ризы сгибают гранулы в 1,5 миллилитрах холодного буфера с высоким содержанием соли и выдерживают 20 минут на льду.

Центрифугируйте при 16 000 раз, G в микроцентрифуге при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. После отжима снимите суп и храните его при температуре четыре градуса Цельсия. Это фракция CH 500.

Выньте фракции, сохраненные во время протокола фракционирования, и положите их на лед. Затем к цитоплазматической фракции добавьте 300 микролитров пяти моляров хлорида натрия. Затем переложите 100 микролитров упакованного стрептококка Т в шариках Sphero на фракцию в коническую трубку объемом 15 миллилитров.

Добавьте в бусины 10 объемов буфера для стирки стрептококка. Переверните пробирку для перемешивания и центрифугируйте в течение пяти минут 1000 раз. G в настольной центрифуге, выбросьте сна.

Повторите промывку буфера дважды, а затем Риз согните гранулы в равный объем стрептококка промойте буфер, добавьте по 200 микролитров промытых стрептококков в виде суспензии на каждую фракцию. Вращайте трубки в течение одного часа при температуре четыре градуса Цельсия. Затем центрифугируйте пробирки в течение одной минуты при температуре 1000 G четырех градусов Цельсия, выбросьте супинат.

Затем добавьте один миллилитр промывочного буфера в бусины для бусин, инкубированных с цитоплазматической фракцией в 15-миллилитровой пробирке. Добавьте буфер для промывки и переложите шарики в тюбик объемом 1,5 миллилитров. Промойте шарики в течение одной минуты, затем центрифугируйте пробирки в течение одной минуты при 1000 G при четырех градусах Цельсия.

Повторите дважды после последнего этапа стирки. Удалите все следы промывочного буфера с помощью плоского наконечника для дозатора. Затем добавьте 100 микролитров элюцианского буфера и аккуратно перемешайте и поместите трубки на лед на 15 минут.

Во время инкубации время от времени перемешивайте шарики, слегка постукивая по дну трубок. По прошествии 15 минут центрифугу выбрать на одну минуту при температуре 1000 раз G при четырех градусах Цельсия. Соберите Senna, содержащую элюированный стрептококк, помеченный как VRP.

Наши клетки были инфицированы штаммом вируса гриппа, WSN, в течение девяти часов, а фракционированные лизаты были проанализированы методом западного цветения, как показано здесь. Щадящая ядерная изоляция эффективно экстрагирует цитоплазматические белки, такие как тубулин, избегая при этом высвобождения большого количества ядерных белков. Обратите внимание, что фракция хроматина, экстрагированная с низким содержанием соли, обогащена белками, важными для транскрипции.

В то время как высокосолевая фракция содержит в основном нуклеосомы для определения белкового состава элюированной цитоплазматической фракции, V NPS из R-клеток, инфицированных в течение девяти часов немеченным вирусом, RWSN или RWSN PB два стрептококка, были проанализированы путем окрашивания серебром, как показано для цитоплазматического элюата. Здесь наблюдается высокое отношение NP к PA PB 1, PB 2, о чем свидетельствует большая полоса выше 55 килодальтон по сравнению с полосами между 95 и 100 килодальтонами, что позволяет предположить, что большая часть стрептококкового PB 2 очищается как часть полностью сформированного VRNP, или, другими словами, улавливается мало растворимой полимеразы для сравнения относительных выходов. VR NPS, очищенный после девяти часов заражения RWSN, PB, двумя стрептококками или RWSN или окрашенным серебром, как показано на рисунке с серебряным окрашиванием, гель против RMP может быть очищен от всех четырех клеточных фракций через девять часов после заражения.

Самая высокая концентрация v RMP обнаружена в ядерной плазме, хотя значительные части также могут быть очищены от цитоплазмы и хроматина. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как очищать высокие выходы интактных рибонуклеопротеиновых комплексов вируса гриппа из ядра инфицированных клеток. При выполнении этой процедуры важно помнить об использовании чистых буферов и избегать ненужного воздействия на образцы комнатной температуры, потому что таким образом можно избежать деградации как РНК, так и белка, а также избежать разборки белкового комплекса.

И не забывайте, что работа с инфекционным вирусом гриппа может быть опасной. Все этапы должны выполняться на рабочем столе второго уровня биобезопасности до тех пор, пока NP 40 не будет добавлен в лизаты.