Два способа формирования гетерокариона Обнаружение вируса гепатита факторы ограничения

Целью данной процедуры является исследование влияния рестрикционных факторов на завершение цикла репликации вируса гепатита C в любой заданной клеточной линии с использованием двух методов, основанных на образовании гетерокарионов. Для первого метода начните с культивирования клеток печени человека, а также упаковочных клеток HepA и Hep 56 1D. Далее с помощью электропорации трансфицируйте РНК вируса гепатита C (HCV RNA) в клетки печени. Впоследствии, используя второй метод слияния, объедините линию клеток, в которых реплицируется HCV, с соответствующей линией упаковочных клеток с помощью полиэтиленгликоля. Первым этапом является получение стока HCV с высоким титром.

Затем проводят совместное культивирование различных клеточных линий, и слияние клеток индуцируют путем трансфекции гликопротеином прототипа пенистого вируса. Далее гетерокарионы инфицируют HCV. После применения любого из методов формирования гетерокарионов проводят флуоресцентную микроскопию для подтверждения слияния и количественно определяют продукцию инфекционных частиц.

Основное преимущество данной методики заключается в том, что она полезна для скрининга широкой панели клеточных линий и первичных клеток на экспрессию специфических доминантных факторов рестрикции ВГС. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о видовой специфичности и нормах ВГС. Визуальная демонстрация данного метода имеет решающее значение для облегчения понимания основополагающих концепций двух систем слияния перед индукцией слияния клеток с помощью полиэтиленгликоля.

Клетки HUH 7.5 трансфецируют H-C-V-R-N-A согласно стандартным протоколам и культивируют в течение 24 часов при 37 °C и 5% carbon dioxide. На следующий день собирают трансфецированные клетки HUH 7.5, содержащие субгеномный репликон, а также упаковочные клетки heal R и he 56 1D. Данные упаковочные клетки были модифицированы для эктопической экспрессии белков HCV core E one, E two P seven и NS two. После трипсинизации клетки ресуспендируют в полной среде DMEM и разводят клеточные суспензии до следующих концентраций: HUH 7.5 — до 5×10⁵ клеток/мл, а клетки heal и hep 56 1D — до 2×10⁵ клеток/мл.

Затем подготовьте 6-луночный культуральный планшет, поместив в каждую лунку по два-три стерильных стеклянных покровного стекла. Для последующего анализа эффективности слияния смешайте 1 ml трансфицированных клеток HUH 7.5 с 1 ml упаковочных клеток и посейте смесь в одну лунку 6-луночного планшета; инкубируйте в течение 24 часов при 37 °C и 5% CO2. По истечении 24 часов проверьте плотность клеток.

Плотность клеток перед индукцией слияния должна составлять от 60 до 80% конфлюэнтности, чтобы клетки находились в непосредственной близости друг от друга для слияния клеточных мембран. Аспирируйте среду из совместно культивируемых клеток и однократно промойте их 1 mL PBS. Затем осторожно добавьте 500 µL предварительно нагретого 40% полиэтиленгликоля или PEG 1,500. В другую лунку с совместно культивируемыми клетками добавьте 500 µL PBS в качестве контроля. Инкубируйте в течение пяти минут при 37 °C для индукции образования гетерокарионов. Аспирируйте PEG и осторожно добавьте 2 mL PBS. Через одну минуту аспирируйте PBS и добавьте 2 mL свежего PBS. Промойте PBS 3–5 раз по одной минуте на каждую промывку, чтобы удалить излишки PEG.

Наконец, добавьте по 2 мл полной среды DMEM в каждую лунку и инкубируйте при 37 °C и 5% CO₂ в течение 48 часов. Через 48 часов после слияния соберите супернатанты (SNAT) из каждой лунки и профильтруйте их через фильтр с порами 0,45 мкм. После сбора культуральной жидкости эффективность слияния можно определить с помощью иммунофлуоресценции; промойте лунки с покровными стеклами один раз 1 мл PBS в течение одной минуты.

Фиксируйте клетки 600 µL 3% паральдегида в PBS в течение 15 минут. Трижды промойте клетки PBS по одной минуте на каждую промывку; после финальной промывки используйте пинцет для осторожного переноса покровных стекол в 24-луночный планшет. Пермеабилизуйте клетки 500 µL 0,5% Triton X 100 в PBS в течение пяти минут.

Затем трижды промойте лунки раствором PBS и внесите в каждую по 250 microliters раствора первичных антител. Используйте антитела anti NS five a в концентрации 0.5 micrograms per milliliter и моноклональные антитела человека anti E two в концентрации 6.4 nanograms per milliliter. Инкубируйте в течение 45 минут при комнатной температуре, после чего трижды промойте раствором PBS.

Затем добавьте в каждую лунку 250 µL вторичных антител; в концентрации 2 µg/mL используют козьи антитела против мышиных или козьи антитела против человеческих IgG, конъюгированные с Alexa Fluor 546 или Alexa Fluor 488. Инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте. По истечении 30 минут один раз промойте PBS.

Затем окрасьте ядра клеток, добавив 250 microliters DPI, разведенного в PBS в соотношении 1:3000. Инкубируйте в течение одной минуты при комнатной температуре в темноте, промойте четыре раза PBS и один раз водой. В завершение закрепите покровные стекла перевернутым положением на каплю среды Flora Mount на предметном стекле и оставьте их высыхать в темноте.

Для начала данной процедуры соберите и подготовьте суспензии единичных клеток следующих типов: клеточную линию печени человека Luna NA, лишенную эндогенной экспрессии CD 81; клетки для упаковки He r и клетки Hep 56 1D, стабильно экспрессирующие человеческий CD 81. Проведите совместное культивирование клеток Luna n с клетками he r в соотношении 1:1 и с клетками Hep 56 1D HCD 81 в соотношении 1:2, чтобы получить общую плотность клеток 1.5 × 10⁵ клеток на 12.

Инкубируйте лунки в течение 24 часов при 37 °C и 5% carbon dioxide. На следующий день проведите транзиентную трансфекцию клеток высокогенным белком оболочки PFE с помощью lipectomy 2000 в соответствии с инструкциями производителя. Через 30 часов после трансфекции гликопротеином PFE инокулируйте гетерокароны 350 µL предварительно приготовленного вирусного стока при MOI около 2.3.

Инкубируйте в течение 12 часов при 37 °C и 5% carbon dioxide. На следующее утро один раз промойте PBS и добавьте по 1 мл полной среды DMEM в каждую лунку; инкубируйте в течение 48 часов при 37 °C и 5% carbon dioxide. По истечении 48 часов соберите супернатант культур гетерокарионов и профильтруйте его через фильтр с размером пор 0.45 micron. Затем используйте супернатант для инокуляции клеток HUH 7.5, высеянных в 96-луночные планшеты накануне, в рамках анализа методом лимитирующего разведения; инкубируйте в течение 72 часов перед количественным определением продукции инфекционных дочерних частиц.

Процедуру визуализации событий слияния необходимо завершить за шесть часов до совместного культивирования. Промойте адгезивные клетки один раз пятью миллилитрами PBS, затем добавьте четыре миллилитра соответствующего раствора DI на одну чашку диаметром 10 см. Инкубируйте клетки в течение 45 минут при 37 °C и 5% carbon dioxide. Промойте клетки один раз пятью миллилитрами PBS в течение одной минуты, после чего добавьте полную среду DMEM. Инкубируйте в течение шести часов при 37 °C и 5% carbon dioxide перед посевом. В каждую лунку 12-луночного планшета поместите покровное стекло, после чего проведите посев и трансфекцию, а также окрашивание клеток, как было показано ранее. Через 30 часов после трансфекции осторожно промойте клетки одним миллилитром PBS в течение одной минуты, затем зафиксируйте клетки, добавив 250 µL 3%paraldehyde, и выдержите в течение 15 минут при комнатной температуре.

Промойте клетки один раз 1 ml PBS в течение одной минуты, затем проведите окрашивание dappy в течение одной минуты; после однократной промывки клеток PBS и один раз водой закрепите покровные стекла, защитные очки и предметные стекла. В первом подходе для исследования влияния факторов рестрикции на завершение цикла репликации HCV в гетерокаронах клетки HUH 7.5 сначала подвергали транзиентной трансфекции субгеномным репликоном, экспрессирующим трансген люциферазы и неструктурные белки HCV, а затем культивировали их совместно и сливали с клеточными линиями, экспрессирующими структурные белки core и вспомогательные белки HCV. Репрезентативный результат представлен на данном рисунке; клетки подвергнуты иммуноокрашиванию с использованием моноклональных антител к структурному белку E2 и неструктурному белку NS5A.

Изображения на верхних панелях показывают, что после обработки PEG одновременно в одной и той же цитоплазме были обнаружены сигналы как от MS five A, так и от D two, что указывает на самослияние. Напротив, на нижних панелях видно, что при обработке кокультивируемых клеток PBS слияние не индуцировалось. Таким образом, колокализации сигналов не наблюдалось. Для количественной оценки вирусной инфекционности, полученной из гетерокарионов, супернатанты собирали из кокультур через 48 часов после индукции слияния и использовали для инокуляции наивных клеток HUH 7.5 с последующим проведением люциферазного анализа.

На этом графике представлены средние значения трех независимых экспериментов. Серая горизонтальная полоса представляет собой фоновый уровень относительных единиц света (RLU), определенный в неинфицированных клетках HUH 7.5. Примечательно, что при слиянии репликантных клеток HUH 7.5 с наивными клеточными линиями или при обработке PBS в качестве контроля инфицированность в культуральных жидкостях не обнаруживалась.

Однако при индукции слияния клеток репликона HUH 7.5 и упаковочных клеточных линий с помощью PEG в культуральную среду высвобождались инфекционные вирусные частицы. Это указывает на то, что для продукции вируса требуется слияние клеток и экспрессия вирусных белков в упаковочных клеточных линиях; при этом заметно, что высвобождение вируса происходило не только в гетерокарионах клеток гепатомы человека HUH 7.5, но и в гетерокарионах с неживыми клетками человека и клетками печени мыши, что свидетельствует о том, что сборка и высвобождение вируса не подавляются существенно возможными факторами рестрикции в данных типах клеток. В качестве альтернативного подхода слияние соматических клеток индуцировали экспрессией генного гликопротеина после культивирования клеток.

Гетерокарионы визуализировали путем окрашивания отдельных клеточных линий красителями Cell Tracker перед совместным культивированием и трансфекцией; через 30 часов после трансфекции клетки фиксировали и окрашивали DPI, репрезентативный результат чего представлен на данном рисунке. Слияние двух типов клеток определяется по наличию гетерокариона с гомогенно распределенными красителями в цитоплазме, как показано здесь. Напротив, изображения на нижней панели демонстрируют отсутствие клеток с двойным окрашиванием цитоплазмы, что указывает на отсутствие слияния клеток.

На этом заключительном графике показано, что все факторы проникновения HCV экспрессируются только в гетерокарионах клеток Luna N с клетками HeLa или Hep 56 1D, экспрессирующими человеческий CD 81. В данном случае культуры инокулировали инфекционными частицами HCV. Культуральные жидкости собирали через 48 часов, и выход новых частиц из гетерокарионов определяли методом лимитирующего разведения с использованием наивных клеток-мишеней HUH 7.5. Представлены средние значения трех независимых экспериментов; серая горизонтальная полоса обозначает предел обнаружения метода.

В качестве контроля клетки lunar N были слиты с клетками lunar N, что привело к очень низким уровням инфекционного HCV, близким к пределу обнаружения. Аналогичные результаты были получены при слиянии клеток lunar N с наивными клетками HEP 56 1D. В обоих случаях человеческий CD 81 отсутствовал, поэтому HCV не мог продуктивно инфицировать гетерокарионы.

Напротив, продукция инфекционного вирусного потомства de novo, примерно в десять раз превышающая фоновый уровень анализа, наблюдалась в клетках lunar 10, слитых с heer, и в клетках lunar hand, слитых с клетками HEP 56 1D, экспрессирующими человеческий CD 81. Это указывает на то, что HCV успешно завершил цикл репликации в RetroCars, что исключает экспрессию доминантных факторов рестрикции в данных клеточных линияях. После освоения метода вся экспериментальная процедура может быть выполнена за одну неделю при условии ее правильного проведения.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как генерировать гетерокарионы для идентификации возможных факторов рестрикции вируса гепатита C. Не забывайте, что работа с вирусом гепатита C может быть крайне опасной, поэтому при выполнении данной процедуры необходимо всегда соблюдать меры предосторожности, включая требования к высокому уровню биологической безопасности.