Выделение пупочной вены человека эндотелиальных клеток и их использование в изучении нейтрофилов Переселение в проточных условиях

Общая цель данной процедуры заключается в выделении высококачественных эндотелиальных клеток человека и их использовании для изучения механизмов, регулирующих трансмиграцию нейтрофилов в условиях потока. Для этого сначала выделяют и высевают эндотелиальные клетки пупочной вены человека. На втором этапе клетки распределяют по камерам IBD.

Затем свежевыделенные нейтрофилы человека распределяют по слою активированных эндотелиальных клеток, что приводит к перекатыванию, прочной адгезии и трансмиграции нейтрофилов. Заключительным этапом является количественная оценка трансмиграции с помощью видеомикроскопии. В конечном итоге для оценки трансмиграции нейтрофилов через активированные эндотелиальные клетки можно использовать флуоресцентную и светлопольную микроскопию.

Изоляцию эндотелиальных клеток легко описать, но трудно освоить, отчасти потому, что ключевые этапы требуют визуального контроля при работе с пуповиной. По этой причине наглядная демонстрация данного метода имеет критически важное значение. Этот метод поможет нам ответить на ключевые вопросы в области воспаления, такие как механизмы рекрутирования лейкоцитов в условиях потока, а также позволит лучше понять поведение эндотелиальных клеток в условиях потока.

Хотя этот метод позволяет получить представление о привлечении нейтрофилов при воспалении, его также можно применять к редким популяциям лейкоцитов, таким как натуральные киллеры и эозинофилы. Данную процедуру вместе с Риту Шармой демонстрирует Хонг Джанг, техник моей лаборатории. По крайней мере за один час до процедуры подготовьте и затем инкубируйте T 75 флакон с желатином при 37 °C.

Затем приступите к процедуре выделения эндотелиальных клеток в ламинарном шкафу, отрезав ножницами пуповину от плаценты. После смены перчаток на стерильные внимательно осмотрите пуповину и удалите любые участки, содержащие тромбы или поврежденные в результате зажима пуповины при родах. Затем определите две артерии и одну вену, находящиеся в пуповине.

Затем осторожно введите в один конец вены канюлю с прикрепленным к ней двухходовым краном, после чего зафиксируйте канюлю в этом положении с помощью зажима. Одной из самых сложных частей процедуры является перфузия пуповины. Чтобы обеспечить успешное выполнение этого этапа, проведите перфузию пуповины избытком буфера и наблюдайте за потоком до тех пор, пока жидкость не станет прозрачной.

Промывайте вену буфером для пуповины до тех пор, пока вытекающая жидкость не станет прозрачной, после чего пережмите конец пуповины зажимом. В процессе перфузии иногда обнаруживаются небольшие отверстия, которые остаются после забора врачами пуповинной крови. В таких случаях для перекрытия отверстий можно использовать гемостатические зажимы, что позволит продолжить перфузию и выделить эндотелиальные клетки.

Крайне важно точно соблюдать время обработки коллагеназой. Слишком короткое время приведет к недостаточному выходу эндотелиальных клеток, а слишком длительное может вызвать загрязнение гладкомышечными клетками или повреждение самих эндотелиальных клеток. Затем проведите перфузию вены свежеприготовленным теплым раствором коллагеназы.

Закройте кран и инкубируйте пуповину в стакане с теплым буфером для пуповины. Через 10 минут извлеките пуповину и осторожно помассируйте ее, чтобы отделить эндотелиальные клетки от просвета вены. Слейте раствор в пробирку, содержащую пять миллилитров среды для эндотелиальных клеток или ECM, дважды промыв пуповину буфером для пуповины, чтобы удалить все оставшиеся клетки.

Теперь центрифугируйте клетки в течение 10 минут при 350 $\times$g. При комнатной температуре удалите супернатант, а затем ресуспендируйте осадок. В 10 мл среды для эндотелиальных клеток перенесите клетки в T 75 флакон с гелатиновым покрытием и культивируйте эндотелиальные клетки в течение ночи при 37 °C и 5% $\text{CO}_2$. На следующий день осторожно встряхните флакон, чтобы удалить любые эритроциты.

Затем удалите супернатант и промойте культуру эндотелиальных клеток теплым HBSS. После удаления HBSS добавьте к клеткам 10 milliliters теплой среды ECM. Затем исследуйте клетки под микроскопом, чтобы убедиться в удалении эритроцитов, а также оценить степень конфлюэнтности и морфологию эндотелиальных клеток.

Продолжайте менять среду каждые три дня до достижения клетками конфлюэнтности. После этого проведите пассирование клеток, используя раствор трипсина и ЭДТА. Затем соберите отделившиеся клетки и ресуспендируйте их в ECM.

Наконец, покройте каждую лунку камеры для IBD желатином. Удалите излишки желатина, а затем добавьте в каждую лунку камеры суспензию эндотелиальных клеток в концентрации 1,5 × 10⁶ на миллилитр. Начните с индуцирования повышения экспрессии молекул адгезии и активации на поверхности клеток, инкубируя эндотелиальные клетки с соответствующим стимулятором в процессе их активации.

Выделите нейтрофилы из периферической крови здоровых добровольцев методом центрифугирования в градиенте плотности согласно ранее опубликованному методу, затем суспендируйте клетки в HBSS с добавлением человеческого альбумина до концентрации 1 × 10⁶ на мл. После настройки микроскопа подсоедините камеру IBD со стимулированными эндотелиальными клетками к трубкам микроскопа. Выберите фазоконтрастный объектив 10x, затем настройте шприцевой насос на забор жидкости и начните подачу HBSS с требуемым напряжением сдвига.

Кратковременно остановите поток, повернув трехходовой кран на стороне выхода в положение «выключено» (off) и переключив входную линию с HBSS на изолированные нейтрофилы. Снова запустите поток, повернув кран в положение «включено» (on). Затем начните запись с помощью CCD-камеры, подключенной к DVD-рекордеру.

Запустите таймер. Когда через четыре минуты нейтрофилы попадут в камеру, снова переключитесь на HBSS, чтобы предотвратить прикрепление новых нейтрофилов. Если требуются данные по общему количеству взаимодействий, включая роллинг и прочную адгезию, используйте фазово-контрастный объектив с увеличением 10x.

Используйте объектив для получения изображений шести случайных полей по 10 секунд каждое в интервале между четвертой и пятой минутами. В завершение переключитесь на объектив 40 x и запишите одно поле зрения в интересующий момент времени. После перфузии нейтрофилами на 10-й минуте соберите от пяти до 10 случайных полей зрения.

Нестимулированные эндотелиальные клетки не способствуют привлечению нейтрофилов. Поэтому на следующих рисунках показано взаимодействие нейтрофилов с эндотелиальными клетками, стимулированными TNF alpha. Обратите внимание на адгезированный нейтрофил, отмеченный желтым наконечником стрелки, и на трансмигрирующий нейтрофил, отмеченный белым наконечником стрелки.

Трансмиграция нейтрофилов может происходить либо на стыке клеток, либо через сами эндотелиальные клетки. Для разграничения этих двух условий эндотелиальные клетки были помечены антителами к VE-кадгерину. Как показано здесь красным цветом, трансмиграция оценивается как парацеллюлярная или трансцеллюлярная.

В данной модели практически вся трансмиграция происходит парацеллюлярно, что демонстрирует этот рисунок, представляющий собой совмещение двух предыдущих изображений. На первом из трех графиков представлены результаты анализа и измерения взаимодействий нейтрофилов с помощью программного обеспечения Image J. Обратите внимание, что количество взаимодействий нейтрофилов с эндотелиальными клетками, активированными TNF alpha, было значительно выше, чем с контрольными нестимулированными эндотелиальными клетками.

Общее количество взаимодействующих клеток далее характеризовали как катящиеся, плотно прикрепившиеся или трансмигрирующие, как и ранее. Значительно более выраженная трансмиграция нейтрофилов наблюдалась в лунках, содержащих активированные эндотелиальные клетки после их изоляции. Для получения дополнительных ответов на вопросы, касающиеся биологии эндотелиальных клеток после развития, могут быть применены другие методы, такие как вестерн-блоттинг, ПЦР в реальном времени и измерение эндотелиального сопротивления.

Данный метод поможет исследователям в области воспаления и биологии сосудов понять механизмы привлечения лейкоцитов в условиях потока в модельной системе человека. После просмотра этого видео вы получите четкое представление о том, как выделять эндотелиальные клетки пупочной вены человека и использовать их для изучения трансмиграции нейтрофилов в условиях потока с помощью камеры ити.