Выделение пупочной вены человека эндотелиальных клеток и их использование в изучении нейтрофилов Переселение в проточных условиях

Общая цель данной процедуры заключается в выделении высококачественных эндотелиальных клеток человека и их использовании для изучения механизмов, регулирующих трансмиграцию нейтрофилов в условиях обратного потока (underflow). Это достигается путем первоначального выделения и посева эндотелиальных клеток пупочной вены человека. На втором этапе клетки переносятся в камеры IBD.

Затем свежевыделенные нейтрофилы человека распределяют по поверхности активированных эндотелиальных клеток, что приводит к перекатыванию, прочной адгезии и трансмиграции нейтрофилов. Заключительный этап заключается в количественной оценке трансмиграции с помощью видеомикроскопии. В конечном итоге для оценки трансмиграции нейтрофилов через активированные эндотелиальные клетки можно использовать флуоресцентную и светлопольную микроскопию.

Процесс изоляции эндотелиальных клеток легко описать, но трудно освоить, отчасти потому, что ключевые этапы требуют визуального контроля при работе с пуповиной. По этой причине визуальная демонстрация данного метода имеет критическое значение. Этот метод поможет нам ответить на ключевые вопросы в области воспаления, такие как механизмы привлечения лейкоцитов в условиях потока, а также позволит лучше понять поведение эндотелиальных клеток в условиях потока.

Хотя этот метод позволяет изучить рекрутирование нейтрофилов при воспалении, его также можно применять для редких популяций лейкоцитов, таких как естественные киллеры и эозинофилы. Эту процедуру вместе с Риту Шармой демонстрирует Хонг Джанг, техник моей лаборатории. Минимум за один час до начала процедуры предварительно подготовьте и инкубируйте при 37 °C флакон T 75 с желатином.

Затем начните процедуру выделения эндотелиальных клеток в ламинарном шкафу, используя ножницы, чтобы отрезать фрагмент пуповины от плаценты. После смены перчаток на стерильные внимательно осмотрите пуповину и удалите любые участки, содержащие сгустки крови или поврежденные в результате зажима пуповины при родах. Затем определите две артерии и одну вену, находящиеся в пуповине.

Затем аккуратно вставьте в один конец вены канюлю с прикрепленным к ней двухходовым краником, после чего зафиксируйте канюлю в этом положении с помощью зажима. Одним из самых сложных этапов процедуры является перфузия пуповины. Чтобы обеспечить успешное выполнение этого этапа, перфузируйте пуповину избытком буфера и наблюдайте за потоком до тех пор, пока жидкость не станет прозрачной.

Проводите перфузию вены буфером для пуповины до тех пор, пока вытекающая жидкость не станет прозрачной, затем пережмите конец пуповины. Иногда в процессе перфузии обнаруживаются небольшие отверстия, возникшие из-за забора пуповинной крови врачами. В таких случаях для перекрытия отверстий можно использовать гемостатические зажимы, что позволит продолжить перфузию и выделить эндотелиальные клетки.

Критически важно точно соблюдать время обработки коллагеназой. При недостаточном времени воздействия будет собрано недостаточное количество эндотелиальных клеток, а при слишком длительном — может произойти загрязнение гладкомышечными клетками или повреждение эндотелиальных клеток. Затем проведите перфузию вены свежеприготовленной теплой коллагеназой.

Закройте стопорный кран и инкубируйте пуповину в стакане с теплым буфером для пуповины. Через 10 минут извлеките пуповину и осторожно помассируйте ее, чтобы отделить эндотелиальные клетки от просвета вены. Слейте раствор в пробирку, содержащую пять миллилитров среды для эндотелиальных клеток или ECM, дважды промывая пуповину буфером для пуповины, чтобы удалить все оставшиеся клетки.

Теперь центрифугируйте клетки в течение 10 минут при 350 ×g. При комнатной температуре удалите супернатант, а затем ресуспендируйте осадок. В 10 мл среды для эндотелиальных клеток перенесите клетки в покрытый желатином флакон T 75 и культивируйте эндотелиальные клетки в течение ночи при 37 °C и 5% CO2. На следующий день осторожно встряхните флакон, чтобы удалить любые эритроциты.

Затем удалите супернатант и промойте культуру эндотелиальных клеток теплым HBSS. После удаления HBSS добавьте клеткам 10 миллилитров теплой ECM. Затем исследуйте клетки под микроскопом, чтобы убедиться в удалении эритроцитов, а также оценить степень конфлюэнтности и морфологию эндотелиальных клеток.

Продолжайте менять среду каждые три дня, пока клетки не достигнут конфлюэнтности. После этого разделите клетки, используя раствор трипсина и ЭДТА. Затем соберите отделившиеся клетки и ресуспендируйте их в ECM.

Наконец, покройте каждую лунку камеры IBD желатином. Удалите излишки желатина, затем добавьте в каждую лунку камеры 1,5 × 10⁶ клеток эндотелиальной суспензии на миллилитр. Начните с индукции ап-регуляции экспрессии молекул адгезии и активации на поверхности клеток, инкубируя эндотелиальные клетки с соответствующим стимулятором в процессе их активации.

Выделите нейтрофилы из периферической крови здоровых добровольцев методом центрифугирования в градиенте плотности согласно ранее опубликованному протоколу, затем суспендируйте клетки в концентрации 1 × 10⁶ на мл в HBSS с добавлением человеческого альбумина. После настройки микроскопа подсоедините камеру IBD, содержащую стимулированные эндотелиальные клетки, к трубкам микроскопа. Выберите фазовый контрастный объектив 10х, затем настройте шприцевой насос на забор жидкости и начните подачу HBSS с требуемым касательным напряжением.

Кратковременно остановите поток, повернув трехходовой кран на выходе в положение «выключено» и переключив входную линию с HBSS на изолированные нейтрофилы. Снова запустите поток, повернув кран в положение «включено». Затем начните запись с помощью ПЗС-камеры, подключенной к DVD-рекордеру.

Запустите таймер. Когда через четыре минуты нейтрофилы попадут в камеру, переключитесь обратно на HBSS, чтобы предотвратить прикрепление новых нейтрофилов. Если требуются данные об общем количестве взаимодействий, включая роллинг и прочную адгезию, используйте фазово-контрастный объектив 10x.

Используйте объектив для получения изображений шести случайных полей по 10 секунд каждое в интервале между четвертой и пятой минутами. Затем переключитесь на объектив 40x и запишите одно поле зрения в интересующий момент времени. После перфузии нейтрофилов на 10-й минуте соберите от пяти до 10 случайных полей зрения.

Нестимулированные эндотелиальные клетки не способствуют привлечению нейтрофилов. Таким образом, на следующих изображениях показано взаимодействие нейтрофилов с эндотелиальными клетками, стимулированными TNF alpha. Обратите внимание на адгезивный нейтрофил, отмеченный желтым наконечником стрелки, и на трансмигрирующий нейтрофил, обозначенный белым наконечником стрелки.

Трансмиграция нейтрофилов может происходить либо через межклеточные контакты, либо через сами эндотелиальные клетки. Чтобы разграничить эти два условия, эндотелиальные клетки были помечены антителами к VE-кадгерину. Как показано здесь красным цветом, трансмиграция оценивается как парацеллюлярная или трансцеллюлярная.

В этой модели практически вся трансмиграция носит парацеллюлярный характер, что наглядно демонстрирует данный рисунок, представляющий собой совмещение двух предыдущих изображений. На первом из трех графиков представлены результаты анализа и измерения взаимодействий нейтрофилов с помощью программного обеспечения Image J. Обратите внимание, что количество взаимодействий нейтрофилов с эндотелиальными клетками, активированными TNF alpha, было значительно выше, чем с контрольными нестимулированными эндотелиальными клетками.

Общее количество взаимодействующих клеток далее характеризовали как катящиеся, прочно прикрепившиеся или трансмигрирующие, как и ранее. Значительно большая трансмиграция нейтрофилов наблюдалась в лунках, содержащих активированные эндотелиальные клетки после их выделения. Для получения ответов на дополнительные вопросы, касающиеся биологии эндотелиальных клеток после развития, могут быть применены другие методы, такие как вестерн-блоттинг, ПЦР в реальном времени и измерение сопротивления эндотелия.

Этот метод поможет исследователям в области воспаления и сосудистой биологии понять, как происходит привлечение лейкоцитов в условиях потока в модельной системе человека. После просмотра данного видео вы получите четкое представление о том, как изолировать эндотелиальные клетки пуповины человека и использовать их для изучения трансмиграции нейтрофилов в условиях потока с помощью камеры ity.