Человека маточных труб модель для исследования

Chlamydia trachomatis представляет собой грамотрицательную облигатно внутриклеточную бактерию. Известны различные серовары хламидий, вызывающие инфекции глаз или мочеполовых путей. Инфекции мочеполовых путей, вызванные Chlamydia trachomatis, являются наиболее распространенным заболеванием, передающимся половым путем, во всем мире.

Их распространенность велика: в Европейском союзе с 1990 по 2009 год было зарегистрировано почти 3 миллиона случаев инфицирования. В 2009 году было зафиксировано почти 400 000 случаев. Несмотря на постоянное совершенствование системы здравоохранения и полового воспитания, наблюдается рост числа новых случаев генитальных хламидийных инфекций — с 70 000 случаев в 1990 году до 400 000 случаев в 2009 году.

О 75% всех новых случаев заражения сообщается среди молодежи в возрасте от 15 до 24 лет. Считается, что клинические последствия возникают из-за неэффективного клиренса патогенов, что может привести к восходящей инфекции из нижних отделов в верхние отделы половых путей и, впоследствии, вызвать хроническое воспалительное повреждение инфицированной ткани. У 10–30% женщин, инфицированных chlamydia tracheitis, развивается воспалительное заболевание органов малого таза (ВЗОМТ), и до 50% случаев ВЗОМТ приписывают инфекциям chlamydia tracheitis.

В результате у 50% пациенток с трубным бесплодием и у 40% пациенток с внематочной беременностью в качестве возбудителя обнаруживаются хламидии. У здоровой неинфицированной женщины оплодотворенная яйцеклетка перемещается по маточной трубе в матку, где она развивается до момента родов. У инфицированных пациенток хламидии могут подниматься из нижних отделов половых путей в маточные трубы, запуская хронические воспалительные процессы.

Предполагается, что вызванное патогеном повреждение эпителиальных клеток и утрата центральных функций эпителия в конечном итоге приводят к окклюзии маточных труб, что влечет за собой снижение или полное прекращение транспорта яйцеклеток из яичников в матку. С этой целью собираются и хранятся маточные трубы женщин, перенесших гистерэктомию. Трубы препарируют и аккуратно вскрывают.

В соответствии со схемой эксперимента, образцы разрезают на небольшие фрагменты и инфицируют элементарными тельцами инфекционного возбудителя chlamydia tracheitis на 24–48 часов до наступления соответствующих временных точек. Образцы фиксируют в фиксаторе Монти не менее трех дней до дальнейшей подготовки. Образцы человеческих маточных труб (HFT) получают от женщин, перенесших гистерэктомию, непосредственно после операции.

В среде RPMI, содержащей 5% FCS без антибиотиков, при температуре четыре градуса Цельсия до начала подготовки. Проведите диссекцию человеческой фаллопиевой трубы в чашке Петри с RPMI и 5% FCS без антибиотиков на протяжении всего процесса обработки. Трубу следует погружать в среду для предотвращения высыхания; необходимо отсечь и удалить соединительную ткань, а также ткани, поврежденные во время хирургического вмешательства.

После диссекции осторожно вскройте HFT с помощью небольшого скальпеля. Избегайте повреждения тканей вследствие неосторожного обращения с пинцетом и скальпелем. Подготовьте небольшие фрагменты ткани размером 5×5 мм для инфицирования; поместите образец HFT в 1 мл среды RPMI, содержащей 5% FCS без антибиотиков, и добавьте C track.

Образцы HFT с элементарными тельцами OMAS инкубируют до 48 часов при 37 °C, 5%CO2 и 20%O2 в обычном инкубаторе или в условиях низкого содержания кислорода (менее 5%O2) в гипоксической камере. После соответствующих временных точек инкубации образцы собирают и хранят в фиксаторе Монти не менее трех дней при 4 °C до подготовки к СЭМ или ПЭМ для просвечивающей электронной микроскопии. Фиксированную ткань разрезают на мелкие фрагменты, промывают и инкубируют с 1% раствором осмиевого тетраоксида в течение ночи.

После нескольких этапов промывки и сушки обезвоженные образцы переносят в свежеприготовленную смолу и полимеризуют в течение 48 часов при 60 °C. После обрезки нарезают полутонкие и ультратонкие срезы, которые затем переносят на предметные стекла или сетки соответственно. После окрашивания полутонкие срезы можно исследовать с помощью светового микроскопа для подготовки к трансмиссионной электронной микроскопии.

Извлеките образец из фиксатора Монти и разрежьте на фрагменты размером до 2×2×5 мм. После промывки, инкубации в буфере для расширения с CCO натрия, промывки тетраоксидом осмия, дегидратации в этаноле с возрастающей концентрацией перенесите образец в смесь 50% пропиленоксида и Эпсикпона (Epon) на ночь. На следующий день перенесите в свежеприготовленный Эпсикпон (Epon) минимум на один час.

Затем перенесите образцы в плоские формы, залейте их эпоксидной смолой и оставьте для полимеризации на 48 часов при 60 °C. После обрезки включенного в смолу образца нарежьте полутонкие срезы толщиной примерно 700 нм или ультратонкие срезы толщиной 70 нм с помощью ультрамикротома, оснащенного стеклянным или, предпочтительно, алмазным ножом. Проанализируйте полутонкие и ультратонкие срезы образца с помощью световой и просвечивающей электронной микроскопии, а также сканирующей электронной микроскопии.

Образцы закрепляют булавками на пробковых пластинах эпителием вверх, промывают и обезвоживают, используя возрастающие концентрации ацетона. После высушивания в установке для сушки в критической точке образцы переносят на предметное стекло для СЭМ и напыляют платиной, золотом или палладием с помощью распылительного напылителя. После этого они готовы к анализу с помощью сканирующего электронного микроскопа для проведения сканирующей электронной микроскопии.

Извлеките образец из фиксатора Монти и ориентируйте фрагмент ткани эпителием вверх на пробковом листе, зафиксировав его энтомологическими булавками. После промывки буфером с дилатацией натрия-кальция и обработки ацетоном высушите образец в установке для сушки в критической точке. После переноса образца с пробки на предметное стекло для СЭМ нанесите проводящее покрытие из платины, золота или палладия с помощью распылителя, затем поместите напыленный образец в сканирующий электронный микроскоп для дальнейшего анализа.

Высокая частота инфекций верхних отделов мочевыводящих путей у женщин и тяжелые клинические последствия восходящих инфекций обуславливают необходимость интенсификации фундаментальных и трансляционных исследований в этой области. Мы использовали разработанную ранее группой St.Perus ex vivo модель ткани человеческой маточной трубы для морфологической характеристики клеточных повреждений в маточной трубе, индуцированных хламидиями. С помощью данного метода наблюдается образование внутриклеточных включений на разных стадиях развития, что позволяет видеть как реплицирующуюся, так и персистирующую инфекции.

Однако экспериментальные данные, подтверждающие наличие персистирующих хламидий в тканях маточных труб человека, все еще отсутствуют и требуют дальнейшего анализа на наличие хламидий, их потомства и повышения уровня транскрипции генов персистенции. Одним из основных ограничений данной модели является отсутствие воспалительных клеток, что затрудняет анализ вторичных эффектов, вызванных первичной глаукоматозной инфекцией KLA. Тем не менее, эта модель представляется подходящей для анализа условий окружающей среды, таких как содержание кислорода, в контексте повреждения эпителиальных клеток маточных труб, а также для изучения первичного иммунного ответа хозяина на острую глаукоматозную инфекцию.

Одной из целей на будущее является создание более детальной модели для определения МПК CTU в модели тканей маточных труб человека с определенным pH, а также использование этой модели для точного определения различных стадий развития CLI на метаболическом уровне с помощью метода двухфотонной лазерной сканирующей микроскопии.