РНК Извлечение из Neuroprecursor ячеек с использованием Bio-Rad Всего РНК Kit

Здравствуйте, я Джош Ш., аспирант лаборатории доктора Эда Маки в Калифорнийском университете в Ирвайне. Я покажу вам, как выделить RNA из нейрональных клеток-предшественников с помощью набора BioRad to RNA mini kit. Я использую этот набор в нашей лаборатории уже несколько лет, и он всегда обеспечивает стабильные результаты с высоким выходом продукта.

Для работы мы используем нейрональные клетки-предшественники на стадии E14.5, которые были подвергнуты острому диссоциированию из эмбриональных кортексов; обычно мы высеваем их в 24-луночный планшет для культивирования тканей с покрытием из поли-D-лизина и ламинатина, используя плотность посева 100 000 клеток на лунку. Прежде чем начать, должен сообщить, что работать следует на специально отведенном лабораторном столе для работы с РНК. Прежде всего необходимо убедиться, что стол для работы с РНК чист.

Для надлежащей очистки рабочей поверхности следует использовать средство RNA zap. По сути, оно уничтожает все остатки РНК, поскольку этот реагент эффективно разрушает молекулы РНК. Также необходимо всегда работать в перчатках при проведении экстракции, так как кожа человека содержит большое количество таких РНК.

Таким образом, этого делать категорически нельзя. Итак, у меня здесь набор BioRad total RA mini kit. Я извлек его содержимое, поэтому позвольте мне показать вам, что в него входит.

Прежде всего, у нас есть PBS, обработанный X dep C, и 70% этанол, обработанный DEP. У нас есть раствор для лицензирования тотальной РНК, в который был добавлен этанол Dan me capital. Вторым является промывочный раствор низкой строгости с добавлением 100% этанола, промывочный раствор высокой строгости, раствор для разведения ДНК, сама ДНК и элюат тотальной РНК.

Затем раствор помещают в термоблок, нагретый до 70 °C. Также нам понадобятся пробирки объемом 1,5 мл с крышками. Убедитесь, что используемые пробирки не содержат ДНК или РНК.

Также у нас есть две пробирки без крышки объемом 2 мл. Но самое главное — это сами колонки для выделения RNA. Без них проведение экстракции RNA невозможно.

Таким образом, для сборки этих колонок вам понадобится колонка для РНК и колпачок объемом 2 мл без прокладки; просто соедините их, и всё будет готово к работе. Итак, последнее, что нам всегда необходимо, — это клетки. В данном случае используются нейральные предшественники из линии Eton 1.5.

Клетки были подвергнуты острому диссоциированию из эмбриональной коры. В течение нескольких дней они культивировались в среде DMEM. Я извлек клетки из инкубатора, установленного на 37 °C.

Данный протокол предназначен для адгезивных клеток. Эти клетки выращивали на 0,4-луночных планшетах для культивирования тканей, имеющих покрытие из PDL и ламинатина. Теперь я возьму вакуумный аспиратор и удалю среду.

Следующим шагом необходимо добавить около 500 µL депилетированного PBS с SEA. Здесь мы снова используем фильтрующие наконечники. PBS в данном случае служит для того, чтобы вымыть остатки среды.

Таким образом, необходимо избегать попадания компонентов среды в колонку для выделения РНК или любого вмешательства в процесс экстракции РНК, иначе вы не получите хороший выход. Хорошо? Теперь я быстро аспирирую PBS, так как нейральные стволовые клетки плохо переносят PBS. Теперь я добавлю по 350 µL лизирующего буфера в каждый образец.

Итак, убедитесь, что вы добавили β-меркаптоэтанол в лизирующий буфер. Теперь я 15 раз перемешаю лизирующий буфер с помощью пипетки, чтобы убедиться в полном лизисе клеток для извлечения содержимого РНК.

Теперь я добавлю 70% деэтилированный этанол в каждую лунку. После добавления 350 µl этого 70% деэтилированного этанола я выполню перемешивание путем десятикратного аспирирования и dispensed из каждой лунки. Я повторил эту процедуру 10 раз для каждой лунки. Теперь я установлю объем на дозаторе более 700 µl, так как общий объем каждой лунки составляет 700 µl.

Затем я перенесу объем жидкости более 700 µL в колонку для выделения РНК. После добавления содержимого в колонку я помещу её в центрифугу и буду центрифугировать в течение 30 секунд на максимальной скорости. После первого центрифугирования лизата я удалю фильтрат, слив его в пустой контейнер.

Также некоторые используют вакуумный шланг, чтобы отсосать фильтрат. Далее добавьте 700 µL буфера для промывки с низкой строгостью. И снова убедитесь, что вы добавили в него этанол.

Теперь я центрифугирую образец в течение 30 секунд на максимальной скорости. После центрифугирования с буфером для промывки с низкой строгостью я удалю фильтрат. Хорошо? Затем я приготовлю раствор ДНК.

Таким образом, в каждый образец необходимо добавить 5 µL ДНК. Мы заранее разделяем ДНК на аликвоты перед началом работы, так как это фермент.

Рекомендуется хранить их в виде аликвот. При хранении в одном общем объеме циклы замораживания и оттаивания приведут к потере ферментативной активности. Поэтому после добавления 5 µL ДНК я разбавлю её 75 µL раствора для разведения ДНК.

После добавления этого компонента общий объем раствора ДНК составит 80 мкл. Теперь я добавлю по 80 мкл раствора ДНК в каждый образец. Убедитесь, что раствор попал непосредственно на мембрану колонки.

Таким образом, раствор ДНК должен пропитать мембрану. Это позволит удалить ДНК и тем самым увеличить выход РНК.

После добавления ДНК оставьте колонку на 15 минут при комнатной температуре, чтобы фермент мог подействовать. Таким образом, инкубация продлится 15 минут. Итак, время вышло.

После 15-минутной инкубации я помещу образцы в центрифугу и буду осаждать ДНК в течение 30 секунд при максимальной скорости. После центрифугирования в течение 30 секунд для осаждения ДНК я удалю фильтрат. Теперь я добавлю 700 µL буфера высокой строгости, чтобы вымыть остатки ДНК.

Затем, после добавления, я снова центрифугирую пробу в течение 30 секунд. После центрифугирования я удалю фильтрат с высокой степенью строгости, просто слив его в контейнер. Затем мы добавим 700 µL буфера с низкой степенью строгости.

Теперь я центрифугирую образец в течение одной минуты на максимальной скорости в Centri Beach. После первого минутного промывания с низкой строгостью я удалю фильтрат. В этот раз я ничего не буду добавлять, но снова центрифугирую образец в течение двух минут, чтобы избавиться от остатков буфера для промывки с низкой строгостью, поскольку он содержит этанол, который может снизить выход РНК.

Теперь я достану буфер для элюции из термоблока с температурой 70 °C. Напоминаю: перед началом эксперимента убедитесь, что буфер для элюции нагрет до 70 °C; необходимо поддерживать его в теплом состоянии, чтобы повысить эффективность выхода РНК. Колонки у меня готовы.

Их центрифугировали. Теперь переходим к следующим шагам: извлекаем колонки. Хорошо, я выброшу эти пробирки с крышками и перенесу их в эти пробирки с крышками.

Добавьте по 50 µL буфера Lucian в каждую колонку. Убедитесь, что буфер попал на мембрану и полностью ее пропитал. В противном случае выход РНК будет низким.

Теперь оставьте колонку на одну или две минуты, чтобы элюат полностью пропитала мембрана колонки. Прошла одна минута. Теперь колонку можно перенести в центрифугу.

Теперь я помещу колонки в центрифугу. Я буду центрифугировать их в течение одной минуты на максимальной скорости. Это последний этап центрифугирования, по завершении которого вы соберете элюат с загрязняющим веществом или РНК в эти пробирки с крышками.

Теперь, после последнего центрифугирования, извлеките содержимое, снимите колонку (ее можно утилизировать), закройте пробирку; теперь образцы можно хранить при температуре -80 °C и использовать их далее по своему усмотрению. Таким образом, я выделил RNA с помощью набора BioRad RNA kit. Теперь я измерю концентрацию выделенной RNA или определю ее OD с помощью спектрофотометра.

Итак, я покажу вам следующее. Сначала нам необходимо приготовить разведения. Мы будем делать разведение 1 к 5.

Мы смешаем нашу РНК с фильтрованной молекулярно-биологической водой. Сначала я приготовлю холостую пробу. Для этого я возьму 2 µL раствора для элюции, который использовался для элюции РНК на начальном этапе, и добавлю 8 µL молекулярной воды. Хорошо?

Итак, это наш холостой образец. Теперь я подготовлю исследуемый образец. Нам потребуется 2 µL нашей целевой RNA.

Мы снова добавим 8 µL воды MQ. Таким образом, получится разведение 1 к 5, верно? У меня есть эта кювета, в которую я помещу свои образцы, а затем установлю эту кювету в спектрометр.

Теперь приступим к измерениям. Прежде чем измерить OD образцов РНК, мне необходимо очистить кювету. Итак, перед нами стеклянная кювета.

Ни в коем случае не прикасайтесь к его передней части. В противном случае на ней останутся отпечатки, и я получу неверные измерения. Поэтому первым делом я промою стеклекювет водой с двойной дистилляцией.

Затем я возьму вакуумный шланг и откачаю воду. После этой промывки я промою образец 95% ethanol, а затем снова воспользуюсь вакуумным шлангом, чтобы удалить ethanol.

Теперь я готов загрузить холостую пробу. Прежде всего нам необходима холостая проба для нормализации показаний. Я возьму 10 µL смеси, которую мы только что приготовили.

Теперь я перемешаю раствор, чтобы добиться однородности. Затем я перенесу его на спектрофотометр. Это прибор Ultra Spec 3, 100 probe, с помощью которого мы измерим концентрацию РНК.

Откройте прибор и поместите образец в один из этих держателей. Мы настроим программу так, чтобы считывалась только РНК. Итак, повторим: мы провели разведение 1 к 5.

Итак, мы хотим установить коэффициент разведения равным пяти. Хорошо, я готов. Теперь я нажму «run» (запуск), чтобы провести измерение холостой пробы.

Хорошо, теперь прибор обнулен. Теперь мы готовы измерить наш образец. Я вынимаю стеклянную кювету.

Я удалю содержимое холостой пробы. Затем я повторно промою её дважды дистиллированной водой. После этого я промою её 5% этанолом девять раз.

Теперь я готов внести 10 µL нашего исследуемого образца. Итак, еще раз убедитесь, что вы перемешали образец. Теперь внесем его в стеклянную кювету.

Теперь мы готовы к считыванию данных. После измерения плотности OD, показатели хорошего выхода и чистоты должны быть следующими: соотношение абсорбции РНК 260/280 должно быть около 2, а выход составляет примерно 144 µg/ml.

Несмотря на то что прибор показывает 72 micrograms per mil, нам необходимо умножить это значение на два из-за половинной длины в наших ветах, два сантиметра. Мы продемонстрировали вам, как экстрагировать RNA из нейропрекурсорных клеток. Снова мы используем набор total mini RNA kit от BioRad. Мы перепробовали другие наборы, и этот оказался лучшим с точки зрения эффективности.

Это позволяет получить РНК высокого качества. При использовании данного набора вы получите такие же качественные результаты, которые мы получаем всегда.