Оптическая запись запороговой нейронной активности с одноклеточных и одного всплеска резолюции

Общая цель эксперимента FollowMe — записать нейронную спайковую активность от большого количества нейронов. Это достигается за счет наблюдения за увеличением внутриклеточной концентрации кальция в соме нейрона, связанного с каждым потенциалом действия, с помощью флуоресцентной микроскопии на первом этапе. Двухфотонное возбуждение и принцип сканирования с произвольным доступом используются для регистрации флуоресцентных сигналов кальция от сомато 40 нейронов с высоким пространственным и временным разрешением.

На втором этапе точные временные интервалы спайков извлекаются из флуоресцентных сигналов с помощью алгоритма деконволюции. Этот метод может быть использован для записи спайковой активности десятков нейронов. Данные о спайках затем могут быть использованы для измерения взаимной информации, распространения сигналов между популяциями нейронов или нейрокорреляций.

Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как запись микроэлектродов, заключается в том, что можно записать пиковую активность нейронов от большого количества нейронов из местной популяции. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о функции коры головного мозга на уровне локальных сетей нейронов, такие как важность корреляций поиска информации и изменения динамики сетей с пластичностью кортико Для двухфотонного возбуждения используется инфракрасная импульсная лазерная система с фемтосекундными импульсами. Высокая выходная мощность лазера необходима для компенсации больших потерь, вносимых оптическими компонентами системы.

Проповедник на систему, состоящую из двух призм, придает лазерным импульсам отрицательную групповую дисперсию скорости перед кустооптическими дефлекторами, чтобы компенсировать временную дисперсию, вносимую AOD: два AOD с большими апертурами отклоняют лазерный луч в двух измерениях. Отражательная дифракционная градация со 100 канавками на миллиметр расположена на 13 сантиметрах позади AOD, чтобы компенсировать пространственную дисперсию, вносимую AOD. При использовании коротких лазерных импульсов лазерный луч направляется двумя телескопами-реле в порт камеры вертикального микроскопа.

Радужные оболочки устанавливаются через равные промежутки времени для юстировки оптических компонентов. Дихроичный светоделитель перед объективом передает инфракрасный возбуждающий свет на образец и отражает флуоресцентный свет от образца на детектор. Эпи и трансфлуоресцентные детекторы собирают флуоресцентный сигнал через объектив, а цветные стеклянные фильтры конденсора размещаются перед детекторами, чтобы предотвратить попадание возбуждающего света на детекторы.

Углы отклонения наружного диаметра A контролируются компьютером, оснащенным платой цифрового аналогового преобразователя, которая, в свою очередь, приводит в действие генераторы, управляемые напряжением. Сигнал от фотоумножителей ретранслируется через фильтр Баттерворта нижних частот с частотой среза 100 килогерц и оцифровывается аналоговым цифровым преобразователем с тактовой частотой 156,25 килогерц перед сохранением на компьютере для анализа, юстировки и проверки электрических шумов путем записи распределения флуоресцентных сигналов с лазерным светом и без него при низком и высоком коэффициенте усиления фотоумножителей. Как и с индикатором, и без него, сканирование с произвольным доступом основано на обнаружении внутриклеточного повышения кальция. Первым шагом в протоколе является окрашивание большого количества нейронов кальциевым индикатором формы Эстер путем болюсной инъекции.

Затем запишите активность сомы в каждом нейроне в четырех местах в течение 6,4 микросекунд в каждом месте. Чтобы выбрать интересующие нейроны, приобретите полный кадр, состоящий из 256 на 256 пикселей. Затем вручную выберите центры нейронов, которые будут записаны на этом изображении.

Три точки на расстоянии двух микрон вокруг каждого центра автоматически добавляются управляющим программным обеспечением в каждом цикле. Флуоресцентный сигнал регистрируется из четырех мест во всех 40 нейронах. Запись со всех нейронов за один цикл занимает 1,536 миллисекунды.

Повторяйте эту последовательную запись всех 40 нейронов в течение пяти секунд. Обнаружение спайков по флуоресцентным соматическим сигналам кальция основано на высоком соотношении сигнал/шум. Высокое соотношение сигнал/шум может быть достигнуто за счет увеличения интенсивности возбуждения.

Однако интенсивность возбуждения может быть увеличена только до определенного предела из-за фотоповреждения. Существует только очень маленькое окно интенсивности возбуждения, когда фотоповреждения низкие, а отношение сигнал/шум достаточно для обнаружения одиночных всплесков, чтобы гарантировать, что записанные сигналы находятся в пределах окна обнаружения высоких всплесков. Во время эксперимента используется ряд программ для онлайн-анализа, разработанных нашей лабораторией.

Затем рассчитайте приблизительную скорость фотонов на нейрон из короткого временного окна базового шума примерно от 100 до 200 миллисекунд. Количество фотонов и скорость фотонов рассчитываются на основе значений флуоресценции путем подгонки распределения относительных изменений флуоресценции к этому уравнению, затем вычисляется базовая флуоресценция из того же временного окна и строится на графике как функция времени или испытаний. Удерживайте среднее снижение базового уровня ниже 0,0002 в секунду, регулируя мощность лазера.

Потому что обнаружение спайков быстро снижается при превышении этого предела. После этого каждые 10-20 минут проверяйте соматическое положение нейронов, получая полнокадровое изображение. При необходимости отрегулируйте места записи.

Флуоресцентные сигналы, возникающие в результате нервной активности, часто съедаются вовремя из-за длительного распада переходного процесса кальция. В этой процедуре используется метод деконволюции для получения пиков и таймингов всплесков из флуоресцентных сигналов. Здесь мы используем генетический алгоритм для определения наиболее вероятной модели цепи спайков, которая соответствует записанному флуоресцентному сигналу.

С каждой итерацией алгоритма максимальное правдоподобие асимптотически приближается к своему максимуму, который задается шумом флуоресцентных записей. В однородных популяциях нейронов спайк, вызванный кальциевым сигналом, может варьироваться между нейронами. Для неконтролируемого анализа больших наборов данных мы разработали алгоритм, который учитывает вариацию вызванного спайком кальциевого сигнала от нейрона к нейрону, чтобы избежать большого количества ложноположительных обнаружений.

Совместное распределение амплитуды и константы времени затухания одного спайка, вызванного кальциевым переходным процессом, зарегистрировано в отдельной серии экспериментов на нейронах того же типа в тех же экспериментальных условиях. Чтобы учесть медленные изменения базовой линии и снизить вычислительные затраты на деконволюцию, более длинные записи делятся на несколько более коротких трасс от одной до пяти секунд для каждого нейрона в каждой записи, алгоритм деконволюции может тестировать большое количество моделей, до 1 миллиона различных моделей или более для ускорения деконволюции. Параллельно.

После деконволюции данные о спайках анализируются и проверяются. Перистимульное время, гистограмма, вероятность всплеска и скорость возбуждения нейронов рассчитываются автоматически. Вот примеры флуоресцентного сигнала, записанного при очень низкой скорости возбуждения, и другого сигнала при очень высокой скорости возбуждения в пределах окна обнаружения.

Обратите внимание, что в каждом примере показана реакция на один всплеск. Здесь показана микрофотография острого среза мозга и двух стимулирующих пипеток, помещенных в одну и ту же кортикальную колонку. В четвертом слое они показывают нейронные реакции на повторяющиеся стимулы, а этот график показывает взаимную информацию Шеннона, сигнализируемую записанной популяцией нейронов.

Вот измерение распространения суперпороговой спайковой активности между различными популяциями корковых нейронов. Это обнаруженные всплески корковых нейронов, реакция на электрическую стимуляцию корковых волокон головного мозга. При записи нейронной активности с помощью сканирования с произвольным доступом очень важно делать запись в пределах окна обнаружения.

В противном случае очень легко получить непригодные для использования наборы данных. Оптическое обнаружение спайков все еще находится в зачаточном состоянии. Есть много возможностей для улучшения.

С некоторыми улучшениями мы записываем от еще большего количества нейронов. С другими улучшениями мы даже сможем записывать бодрствующих и ведущих себя животных.