Функциональные нейровизуализации с использованием ультразвуковых Гематоэнцефалический Разрушение барьеров и марганца-МРТ

Общая цель следующего эксперимента — визуализировать нейронную активность мыши с помощью МРТ, усиленной марганцем. Это делается путем односторонней стимуляции вибрации и картирования нейронного ответа в коре контралатерального бочкообразного поля. Первым шагом является сборка и калибровка ультразвуковой системы, состоящей из несфокусированного ультразвукового преобразователя, приводимого в действие генератором сигнала, и усилителя для эксперимента.

После внутрибрюшинной инъекции марганца гематоэнцефалический барьер открывается с помощью ультразвука и микропузырьков, что позволяет марганцу проникать в паренхиму мозга. Затем мышь подвергается парадигме нейронной стимуляции, что приводит к более высокому накоплению марганца в более активных областях мозга. Наконец, получаются МРТ-изображения, которые показывают региональные различия в интенсивности взвешенного МР-изображения на основе различных уровней накопления марганца в мозге.

В нейробиологии мышь является доминирующей модельной системой для изучения генетических и молекулярных основ развития мозга и заболеваний. Этот метод предоставляет неинвазивный инструмент для картирования нейронной активности в этих моделях мышей. Ультразвуковое разрушение гематоэнцефалического барьера может быть использовано не только для доставки марганца в паренхиму мозга в целях функциональной нейровизуализации, но также может быть использовано для доставки широкого спектра других соединений в паренхиму мозга, включая контрастные вещества на основе гадолиния или химиотерапию.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности с калибровкой ультразвуковой системы и обращением с микрорублями. Демонстрировать процедуру будет каждый из техников в нашей лаборатории. Ультразвуковая система состоит из одноэлементного ультразвукового преобразователя диаметром, достаточно широким, чтобы охватить мозг мыши, и центральной частотой в диапазоне двух мегагерц.

Преобразователь приводится в действие генератором сигналов и усилителем мощности 50 децибел, который воспроизводит последовательность ультразвуковых импульсов. Откалибруйте ультразвуковую систему в резервуаре для воды. Поместите гидрофон на дно бака и расположите над ним датчик с помощью трехосевого ступеня для перемещения.

Затем подайте короткую последовательность синусоидальных импульсов на преобразователь и отрегулируйте столик так, чтобы найти пиковую характеристику, которая должна находиться в центре ультразвукового луча и в естественном фокусе преобразователя. Затем выполните несколько измерений акустического давления в диапазоне входных напряжений и используйте линейную регрессию для оценки взаимосвязи между входным напряжением и акустическим давлением. Найдите амплитуду импульса для создания пикового отрицательного акустического давления около 0,36 мегапаскаля.

На этом этапе обезболите животное, доставляя изофтор через носовой конус. Аппарат носового обтекателя должен точно и надежно фиксировать голову животного в одном и том же положении каждый раз, когда наше устройство удерживает голову в черепе Плоское положение во время эксперимента представляет собой пневматическую подушку для контроля частоты дыхания и титрования анестетика для поддержания частоты дыхания от 85 до 125 вдохов в минуту. При этом контролируйте температуру животного с помощью ректального зонда и поддерживайте температуру его тела с помощью тепловой лампы или продуваемого воздуха.

После этого вставить животному катетер в хвостовую вену и внутрибрюшинный катетер. Следующим шагом является стрижка его волос с целью демонстрации односторонней стимуляции VII и картирования нейронного ответа в коре контралатерального бочкообразного поля. Разрежьте контралатеральный VII как можно ближе к поверхности кожи, не раздражая фолликул или окружающую кожу.

Затем переведите животное в ультразвуковую систему и нанесите ультразвуковой гель на кожу головы, опустите на голову тонкий пластиковый лист, содержащий столб воды. Протяните руку через столб воды ватным тампоном, чтобы вытолкнуть любые пузырьки воздуха, которые попали в ультразвуковой гель. Затем поместите ультразвуковой датчик в воду на его естественном фокусном расстоянии прямо над мозгом мыши и протрите датчик пальцем, чтобы удалить все захваченные пузырьки воздуха.

После этого получите липидные микросферы перрина, встряхивая флакон в мешалке в течение 45 секунд во время работы. Оставьте фиолетовый цвет комнатной температуры, но храните его в холодильнике после последнего использования за день до первого использования. В последующие дни хранящийся флакон взбалтывайте в мешалке. Снова.

Далее вводят 0,5 миллимоля на килограмм хлорида марганца внутрибрюшинно, и ждут 10 минут, чтобы дать возможность его распределения. Затем взбалтывайте флакон с микропузырьками вручную в течение одной минуты, чтобы снова суспендировать микросферы. Впоследствии выводят 30 микролитров плюс мертвый объем катетера.

Будьте осторожны, чтобы не впрыскивать воздух во флакон, так как это приведет к деградации оставшихся микропузырьков. Немедленно начните последовательность ультразвуковых импульсов и введите микросферы через катетер хвостовой вены с минимальной задержкой. Продолжайте сонификацию в течение трех минут.

Затем выключите ультразвуковую систему. После того, как уровень марганца в мозге стабилизируется в течение примерно 40 минут, выключите изофтор и удалите носовой конус. На этом этапе начинается парадигма нейронной стимуляции для картирования коры бочкообразного поля.

Перемещайте кисть круговыми движениями с частотой от одного до пяти герц по контралатеральной вибрационной решетке в течение 90 минут. Возобновите анестезию после стимуляции, затем продолжайте поддерживать температуру тела и титруйте уровень изофтора до частоты дыхания от 85 до 125 вдохов в минуту. Далее поместите мышь в катушку МРТ и перенесите ее в систему МРТ.

Затем получите три взвешенных изображения с высоким разрешением, как показано здесь. Нарушение гематоэнцефалического барьера после введения контрастного вещества, укорачивающего Т-1, такого как марганец или препарат на основе гадолиния, приводит к увеличению сигнала в паренхиме мозга при взвешенной визуализации Т-1 по сравнению с мозгом, в котором БОМА не проводилась. Ниже приведены карты нейронной активности, полученные при односторонней стимуляции ризи у семи животных в первой колонке.

Карты различий в двух разных местах показывают повышенный сигнал МРТ, контралатеральный по отношению к стимулируемому brissy. Во втором столбце карты p-значений указывают на относительную значимость этих различий. В третьем столбце соответствующие диаграммы атласа мозга показывают, что эти активные области соответствуют бочкообразному полю первичной сенсорной коры.

С практикой эта техника может быть выполнена примерно за два часа плюс симуляция продолжительности. При выполнении процедуры важно помнить о том, что перед инъекцией флакон с микропузырьками нужно взбалтывать и быть осторожным, чтобы не впрыснуть воздух во флакон. Кроме того, важно убедиться, что пузырьки воздуха не попали в ультразвуковой гель или под ультразвуковым преобразователем.

Для этой демонстрации мы выбрали стимуляцию усов, но очевидно, что эту технику можно адаптировать для изучения любого интересующего нас стимула. После процедуры животное может полностью восстановиться, что позволяет проводить продольные исследования.