Функциональные нейровизуализации с использованием ультразвуковых Гематоэнцефалический Разрушение барьеров и марганца-МРТ

Общая цель следующего эксперимента заключается в визуализации нейронной активности мыши с помощью МРТ с усилением марганцем. Это осуществляется путем односторонней стимуляции вибрисс и картирования нейронного ответа в контрлатеральной области бочковидного поля коры. Первым этапом является сборка и калибровка ультразвуковой системы, состоящей из нефокусированного ультразвукового преобразователя, управляемого генератором сигналов и усилителем, для проведения эксперимента.

После внутрибрюшинной инъекции марганца гематоэнцефалический барьер открывается с помощью ультразвука и микропузырьков, что позволяет марганцу проникнуть в паренхиму головного мозга. Затем мышь подвергают парадигме нейрональной стимуляции, в результате чего в более активных областях мозга наблюдается более высокая аккумуляция марганца. В завершение получают МР-изображения, которые демонстрируют региональные различия интенсивности Т1-взвешенных МР-изображений в зависимости от различного уровня накопления марганца в головном мозге.

В нейронауках мышь является основным модельным объектом для изучения генетических и молекулярных основ развития и заболеваний головного мозга. Данный метод представляет собой неинвазивный инструмент для картирования нейронной активности в таких мышиных моделях. Ультразвуковое нарушение гематоэнцефалического барьера может быть использовано не только для доставки марганца в паренхиму мозга с целью функциональной нейровизуализации, но и для доставки в паренхиму мозга широкого спектра других соединений, включая контрастные вещества на основе гадолиния или химиотерапевтические препараты.

Как правило, лицам, которые впервые используют данный метод, будет сложно откалибровать ультразвуковую систему и работать с микротрубками. Каждый из технических специалистов нашей лаборатории проведет демонстрацию данной процедуры. Ультразвуковая система состоит из одноэлементного ультразвукового преобразователя с диаметром, достаточным для охвата головного мозга мыши, и центральной частотой в диапазоне 2 MHz.

Преобразователь приводится в действие генератором сигналов и усилителем мощности 50 децибел, которые создают последовательность ультразвуковых импульсов. Откалибруйте ультразвуковую систему в резервуаре с водой. Поместите гидрофон на дно резервуара и расположите преобразователь над ним с помощью трехкоординатного столика перемещения.

Затем подайте на преобразователь короткую серию синусоидальных импульсов и отрегулируйте положение предметного столика, чтобы найти пиковый отклик, который должен находиться в центре ультразвукового луча и в точке естественной фокусировки преобразователя. Далее выполните несколько измерений акустического давления в диапазоне входных напряжений и используйте линейную регрессию для оценки зависимости между входным напряжением и акустическим давлением. Определите амплитуду импульса, необходимую для создания пикового отрицательного акустического давления примерно 0.36 megapascals.

На данном этапе проведите анестезию животного, подавая изофлуран через носовой конус. Аппарат с носовым конусом должен точно и надежно фиксировать голову животного в одном и том же положении при каждом повторении; для того чтобы устройство поддерживало голову в положении «череп в плоскости» (skull Flat) в течение эксперимента, используется пневматическая подушка. Контролируйте частоту дыхания и титруйте анестетик таким образом, чтобы поддерживать частоту дыхания в диапазоне от 85 до 125 вдохов в минуту. Одновременно с этим контролируйте температуру животного с помощью ректального датчика и поддерживайте температуру тела, используя греющую лампу или обдув воздухом.

После этого установите животному катетер в хвостовую вену и внутрибрюшинный катетер. Следующим шагом является выстригание шерсти для обеспечения возможности односторонней стимуляции VII вибриссы и картирования нейронального ответа в коре контрлатерального бочкообразного поля. Отрежьте контрлатеральную VII вибриссу как можно ближе к поверхности кожи, не раздражая фолликул или окружающую кожу.

Затем перенесите животное на ультразвуковую систему, нанесите ультразвуковой гель на скальп и поместите на голову тонкий пластиковый лист с водяным столбом. С помощью ватного тампона через водяной столб удалите все пузырьки воздуха, попавшие в ультразвуковой гель. Затем поместите ультразвуковой датчик в воду на его естественном фокусном расстоянии непосредственно над мозгом мыши и протрите датчик пальцем, чтобы удалить оставшиеся пузырьки воздуха.

Затем приготовьте липидные микросферы Перрина, встряхивая флакон в агитаторе в течение 45 секунд. Держите флакон при комнатной температуре, но после последнего использования за день помещайте его в холодильник до следующего применения. В последующие дни снова перемешивайте хранящийся флакон в агитаторе.

Затем внутрибрюшинно введите хлорид марганца в дозе 0.5 millimole per kilogram и подождите 10 минут для его распределения. После этого в течение одной минуты вручную встряхните флакон с микропузырьками, чтобы ресуспендировать микросферы. Затем наберите 30 µL плюс объем мертвого пространства катетера.

Следите за тем, чтобы в флакон не попал воздух, так как это приведет к разрушению оставшихся микропузырьков. Немедленно запустите последовательность ультразвуковых импульсов и с минимальной задержкой введите микросферы через катетер в хвостовую вену. Продолжайте воздействие ультразвуком в течение трех минут.

Затем выключите систему ультразвукового исследования. После того как уровень марганца в мозге стабилизируется (приблизительно через 40 минут), прекратите подачу изофлурана и снимите носовой конус. На этом этапе начните парадигму нейрональной стимуляции для картирования бочкообразного поля коры.

В течение 90 минут совершайте круговые движения кистью в диапазоне от 1 до 5 Гц через контролатеральный массив вибраторов. После стимуляции возобновите анестезию, продолжая поддерживать температуру тела и титруя уровень изофлурана для достижения частоты дыхания от 85 до 125 вдохов в минуту. Затем поместите мышь в катушку МРТ и перенесите ее в систему МРТ.

Затем получите три Т1-взвешенных изображения высокого разрешения, как показано здесь. Нарушение гематоэнцефалического барьера после введения контрастного вещества, укорачивающего Т1, такого как марганец или препарат на основе гадолиния, приводит к увеличению сигнала в паренхиме головного мозга на Т1-взвешенных изображениях по сравнению с мозгом, в котором BOMA не проводилась. В первом столбце представлены карты нейрональной активности, полученные путем односторонней стимуляции risi у семи животных.

Карты разностей в двух различных точках демонстрируют усиление МРТ-сигнала контрлатерально по отношению к стимуляции вибриссами. Во втором столбце карты p-значений указывают на относимую значимость этих различий. В третьем столбце соответствующие диаграммы атласа мозга показывают, что эти активные области соответствуют бочкообразному полю первичной сенсорной коры.

При наличии опыта выполнение данной методики занимает около двух часов плюс время проведения симуляции. При выполнении процедуры важно помнить о необходимости перемешивания флакона с микропузырьками перед инъекцией и соблюдать осторожность, чтобы не ввести воздух во флакон. Кроме того, необходимо убедиться, что в ультразвуковом геле или под ультразвуковым датчиком не осталось пузырьков воздуха.

Для данной демонстрации мы выбрали стимуляцию вибрисс, однако очевидно, что этот метод может быть адаптирован для изучения любого интересующего стимула. После проведения процедуры животное может полностью восстановиться, что позволяет проводить лонгитюдные исследования.