Покадровый Визуализация нейробластов миграции в остром ломтики мозга взрослых мышей

Мы описываем протокол реального времени videoimaging о миграции нейронов у мышей мозга. Миграция вирусно-меченных или привитые нейрональных предшественников был записан в остром живых срезов при использовании широкого поля флуоресцентных изображений с относительно быстрым приобретением интервал для изучения различных этапах клеточной миграции, в том числе продолжительность стационарного и миграции фазы и скорости миграция.

Общая цель этой процедуры заключается в изучении миграции нейробластов в острых срезах мозга взрослой мыши. Это достигается путем сначала мечения предшественников нейронов во взрослой субвентрикулярной зоне через пять-восемь дней после мечения нейробластами, подготовки острых срезов мыши для мозга. Затем выполняется покадровая визуализация миграции нейробластов.

В конечном счете, широкопольная микроскопия в реальном времени используется для отображения динамики миграции нейробластов в острых срезах. Этот метод может помочь ответить на ключевой вопрос в области развития нейронов путем изучения роли различных молекулярных сигналов и клеточного механизма, связанного с миграцией клеток. В настоящее время этот метод может дать представление о физиологических процессах, регулирующих нейронную миграцию мозга у взрослого человека, но он также может быть применен в других системах, таких как изучение нейронной миграции в ишемизированном мозге и во время эмбрионального развития.

Начните эту процедуру с приготовления искусственной спинномозговой жидкости на основе сахарозы для разрезания срезов и 32 градуса Цельсия на основе хлорида натрия A для поддержания срезов до визуализации, а затем насытьте растворы кислородом, непрерывно наполняя их 95% кислорода и 5% углекислого газа. Затем обезболите мышь флуоресцентно меченным нейробластом с использованием кетамина ксилазина внутрь. Затем быстро приготовьте ледяной холодный раствор для резки с желеобразным видом, используя жидкий азот.

После этого возьмите от 15 до 20 миллилитров ледяного раствора для холодной резки с помощью шприца объемом 20 мл и перфузируйте мышь внутрь Cardi. Если кровеносные сосуды должны быть помечены вместо того, чтобы перфузировать раствором для резки, введите 200 микролитров декстрана техасского красного в концентрации 10 миллиграммов на миллилитр, переведите Cardi в левый желудочек сердца и подождите две-три минуты, прежде чем обезглавливать мышь после транскардиальной перфузии, быстро обезглавьте мышь, погрузите голову в ледяной раствор для резки и переместите ее в вибрато. Разрежьте череп ножницами по сагиттальному шву от мозжечка к обонятельной луковице.

Затем аккуратно удалите черепные лоскуты с помощью щипцов После этого иссеките избалованную часть мозга с помощью скальпеля. Затем сделайте два сагиттальных разреза на самой боковой части каждого полушария, и разрежьте мозг по внутриполушарной щели. Затем аккуратно удалите мозг с помощью шпателя и поместите его в ледяной раствор для холодной резки.

Поместите два полушария отдельно на блок 4%-го агара так, чтобы дорсальная сторона касалась агара. Далее приклейте блок боковой стороной двух полусфер к платформе вибрама медиальной стороной вверх. После этого поместите платформу в камеру Вибрам.

Залейте его раствором для резки. Затем поддерживайте насыщение раствора кислородом на протяжении всего приготовления ломтиков, добавляя в него 95% кислорода и 5% углекислого газа. Теперь подготовьте с помощью вибратора профили толщиной 250 микрон.

Низкая скорость резки и высокочастотная вибрация лезвия должны использоваться для получения высококачественных профилей. Как только ломтик будет выпущен из лезвия, аккуратно извлеките его из режущего раствора и поместите в инкубационную камеру, заполненную кислородосодержащей жидкостью A CSF, поддерживаемой при температуре 32 градуса Цельсия на водяной бане. При этом срез осторожно помещается в камеру визуализации микроскопа, чтобы избежать смещения среза во время визуализации.

Стабилизируйте его, аккуратно поместив сверху капроновую сетку. Убедитесь, что срез постоянно перфузируется спинномозговой жидкостью. Затем используйте цель 10 раз, чтобы найти интересующую область.

Откройте программное обеспечение для метаморфа и убедитесь, что нейлоновая сетка не препятствует полю визуализации. Затем включите объектив 40x и отрегулируйте фокус. Убедитесь, что между целью и срезом достаточно раствора.

С помощью программного обеспечения метаморфа задаются параметры покадровой съемки, такие как продолжительность возбуждения, количество Z-плоскостей, расстояние между каждым Z-участком, временной интервал и продолжительность записи. Затем запустите сбор данных с интервальной съемкой. Данные автоматически сохраняются Metamorph в виде файла tiff, при этом каждый файл соответствует одной временной точке полученного замедленного видео, чтобы открыть фильм в Mrs.Загрузите

полученные изображения, просто перетащив изображение первой временной точки видео в иконку программы. После загрузки фильма отрегулируйте яркость и контрастность сигнала в окне настройки дисплея. Задайте параметры получаемого видео, такие как размер вокселя и временной интервал в свойствах изображения, а также установите равноудаленные временные точки.

После указания размера воксела есть возможность увидеть кадр в 3D, а также время и масштаб видео для автоматического отслеживания записанных ячеек. Создайте пятно для каждой ячейки в поле в окне превышения, выбрав функцию пятен, измерьте диаметр отслеживаемой ячейки в окне среза. Задаем параметры для отслеживания и приступаем.

Проверяйте надежность обнаруженных объектов с течением времени. Если не все мигрирующие ячейки обнаруживаются автоматически, измените порог обнаружения и убедитесь, что все ячейки были выбраны с пятнами во всех временных точках. Максимальное расстояние и максимальный размер промежутка между двумя точками, представляющими соседние временные точки одного и того же трека, должны быть указаны, чтобы программа могла соединить временные точки.

После того, как треки созданы, их можно отфильтровать и удалить нерелевантные треки, просто удалив их. Треки могут быть исправлены путем подключения и отключения разных треков и разных временных точек одного и того же трека, как только все исправления будут сделаны. Просмотрите треки и экспортируйте данные, включая смещение ячеек по временным точкам, длину трека, длину смещения и продолжительность трека, в файл Excel.

В этом видео показана покадровая съемка миграции нейробластов зеленого цвета по кровеносным сосудам с красной меткой в Техасе. Обратите внимание, что мигрирующие нейробласты проявляют сальтационное поведение, когда миграционные фазы прерываются стационарными периодами. А в этом видео показано отслеживание миграции нейробластов программным обеспечением imas.

Сферами и линиями обозначены тела клеток и пути миграции отдельных клеток соответственно. При попытке проведения этой процедуры важно помнить, что необходимо получить качественные срезы переднего мозга взрослой мыши. Кроме того, срезы должны быть хорошо стабилизированы в камере визуализации, осторожно поместив нейлоновую сетку, чтобы избежать смещения среза во время визуализации.

Любые изменения скорости перфузии ликвора, нерегулярная перфузия или резкое изменение температуры могут вызвать дрейф и изменения в фокальной плоскости во время визуализации. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как регистрировать и анализировать миграцию нейробластов в острых срезах взрослого человека. Мы рекомендуем использовать короткий интервал врача от 15 до 30 секунд для надежного определения начала и окончания миграционной и стационарной фаз.