Создание определяемых газообразных сред для изучения влияния гипоксии на С. Элеганс

Целью данного эксперимента является установка и поддержка работы камеры гипоксии с использованием метода непрерывного потока. Это достигается путем подбора и изготовления необходимых трубок, колб и камер для проведения процедуры. На втором этапе следует подключить баллон с кислородом и выбрать скорость потока для создания желаемого уровня гипоксии.

Увлажните газ, пропустив его через колбу с барботером, заполненную деионизированной водой. Подведите увлажненный газ к гипоксической камере и поместите в нее исследуемые образцы для воздействия условий гипоксии. Полученные результаты показывают эмбриональную летальность в условиях гипоксии, зависящую от Hi F1, на основании оценки выживаемости до достижения взрослого состояния.

Основное преимущество данного метода перед существующими способами, такими как использование перчаточных боксов, заключается в простоте и дешевизне изготовления в лабораторных условиях, а также в обеспечении точной и воспроизводимой концентрации газов в режиме окружающей среды. Хотя этот метод позволяет изучить гипоксический ответ у нематоды C elegans, он может быть адаптирован и для других систем, включая более крупные модельные организмы и клеточные культуры. Кроме того, его можно использовать для изучения других газов, включая углекислый газ и сероводород.

В данном протоколе демонстрируется способ создания гипоксической камеры. Газ хранится в баллонах со сжатым газом с определенной концентрацией кислорода, к которым присоединен двухступенчатый регулятор. Газ поступает в нижнюю часть трубки потока и выходит из верхней части с заданной скоростью потока.

Затем газ поступает в барботирующую колбу, где увлажняется. После этого увлажненный газ через впускной клапан проходит в камеру гипоксии, создавая условия гипоксии для образцов. В завершение газ выводится в помещение через отверстие в камере.

В качестве корпуса экологической камеры можно использовать кристаллизационную чашу Pyrex или коробку от упаковки стрел. Объем контейнера должен быть минимальным, а материал — газонепроницаемым. Просверлите отверстие в одной из стенок контейнера сверлом с угольным или алмазным наконечником, после чего установите пластиковый штуцер для шланга.

Перемешайте эпоксидную смолу перед нанесением на коробку и фитинг. Затем повторите ту же процедуру на противоположной стороне контейнера, сместив второе отверстие относительно первого. Для усиления турбулентного перемешивания используйте трубку из FEP или нейлона с внешним диаметром 1/8 дюйма для соединения баллонов со сжатым газом с устройством контроля потока, таким как регулятор массового расхода или ротаметр.

Газовые баллоны должны иметь определенную концентрацию кислорода, сбалансированную азотом, в соответствии с сертифицированным стандартом содержания кислорода или для аноксических условий. При использовании чистого азота применяйте двухступенчатый регулятор, установив вторую ступень на нужное давление. Инструкции по выбору подходящей скорости потока см. в письменном протоколе.

Затем подсоедините трубку от двухступенчатого регулятора к расходомеру, который контролирует скорость потока газа, поступающего в камеру. Выход расходомера соединяется с газопромывалкой с пористым цилиндром, содержащим дистиллированную воду. Затем подсоедините трубку с другой стороны промывалки к одному из патрубков экологической камеры.

Это позволит увлажнить газ, поступающий в климатическую камеру. Используйте вакуумную смазку для герметизации камеры. Затем поместите грузы на крышку камеры, чтобы обеспечить герметичное соединение.

Проверьте герметичность, поднеся небольшое количество воды на ладони в перчатке к патрубку для отвода газа из камеры и убедившись в отсутствии пузырьков. Сначала создайте синхронизированные популяции sea Elgan. Поместите от 1 до 100 взрослых особей GR в каплю раствора щелочного отбеливателя на поверхность чашки с не посеянной средой для выращивания нематод.

Дайте раствору отбеливателя впитаться в агар после инкубации в течение не менее восьми часов. Перенесите синхронизированных личинок стадии L1 на чашку с посевом живых бактерий OP 50. В качестве альтернативы, позвольте взрослым особям GRA откладывать яйца на чашку в течение двух-трех часов для получения группы червей, которые будут развиваться синхронно, или отберите личинок стадии L4 из смешанной популяции для сбора молодых эмбрионов.

На стадии двух–четырех клеток с помощью лезвия бритвы измельчите взрослых особей GR в небольшом объеме воды, затем перенесите эмбрионы с помощью ротового дозатора, после чего поместите червей на чашку для воздействия гипоксических условий. Нанесите кольцо пальмитиновой кислоты в этаноле в концентрации 10 mg/mL по краю чашек, чтобы предотвратить сползание червей с поверхности агаровой среды.

Пальмитиновая кислота выпадет в осадок. По мере испарения этанола, который создаст физический барьер для обеспечения равномерности, обязательно замените воду в газомойке перед помещением в климатическую камеру. После переноса червей на чашки закройте чашки в климатической камере, запустите поток газа и поддерживайте воздействие в течение необходимого для анализа времени.

Для оценки выживаемости эмбрионов до взрослого состояния дайте червям развиваться в течение 48 часов после возвращения к обычному воздуху; к этому моменту они должны достичь стадии личинок четвертого этапа или однодневных взрослых особей. Для визуализации червей после воздействия гипоксии перенесите их в каплю среды M9 на квадратное покровное стекло размером 22 мм и, при необходимости, переверните на подушечку из 2% агарозы в среде M9.

В качестве анестетика можно использовать 25 мМ амола или 10 мМ азида натрия. В качестве альтернативы, после воздействия гипоксии, прозрачную камеру для окружающей среды можно поместить непосредственно на предметный столик диссекционного микроскопа. Представлены два вида: один из них включает всю установку для подачи газового потока.

Второй вариант — только с камерой на предметном столике микроскопа. Вырастите червей штамма Bristol N 2 на четырех чашках Петри высотой 10 сантиметров до тех пор, пока большинство червей не достигнут стадии взрослых GR.

Не более пяти минут. Промойте червей трижды в среде M9, центрифугируя при 1 500 ×g после каждой промывки, не открывая планшет. Распределите отбеленные эмбрионы по восьми 150-миллиметровым чашкам с NGM и дайте эмбрионам развиться до стадии личинок L4 в течение примерно 48 часов.

При температуре 22 °C поместите планшеты в климатическую камеру и выдержите в условиях гипоксии и аноксии в течение четырех часов или в течение времени, предусмотренного дизайном эксперимента. Для сбора образцов быстро снимите крышку гипоксической камеры. Извлеките один планшет с образцами, снова герметично закройте камеру, зафиксируйте время и запишите этапы процедуры.

После извлечения червей из условий гипоксии весь этот процесс должен занять менее двух минут. Используйте дистиллированную воду, чтобы перенести червей на нейлоновый фильтр, а затем перелейте их в маркированную коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 100 µL 1% SDS. Центрифугируйте червей в SDS в настольной центрифуге при 1 500 ×g в течение 15–20 секунд.

После центрифугирования используйте вакуум для удаления большей части супернатанта из пробирки, не затрагивая осадок червей. С помощью пипетки перенесите осадок червей с заранее определенным объемом жидкости в промаркированную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мкл. Если образец предназначен для SDS-PAGE, в пробирку можно добавить равный объем двухкратного буфера для нанесения белков; закройте пробирку и погрузите ее в жидкий азот.

Повторяйте процедуру до тех пор, пока не будут изолированы все образцы. Для обеспечения согласованности данных следуйте этим же процедурам при подготовке контрольных образцов воздуха в помещении; образцы можно хранить при температуре -20 °C. На данном рисунке показана жизнеспособность эмбрионов, подвергшихся воздействию 1000 ppm кислорода, 5000 ppm кислорода и нормоксии (около 210 000 ppm кислорода).

Эмбрионы подвергают воздействию каждого условия в течение 24 часов в камерах с непрерывным потоком кислорода. Червей переносят в условия нормоксии, где они развиваются до взрослого состояния в течение 48 часов, после чего оценивают жизнеспособность до достижения зрелости. После завершения этой процедуры можно собрать образцы для последующего анализа с помощью вестерн-блоттинга, QPCR или физиологических тестов, таких как определение продолжительности жизни или продукции потомства.

После просмотра этого видео вы получите четкое представление о том, как организовать камеру с гипоксией при непрерывном потоке в собственной лаборатории.