Создание определяемых газообразных сред для изучения влияния гипоксии на С. Элеганс

Целью данного эксперимента является создание и обслуживание камеры гипоксии методом непрерывного потока. Это достигается за счет получения и изготовления необходимых для процедуры пробирок, колб и камер. В качестве второго шага подключите кислородный баллон и выберите скорость потока, чтобы создать желаемый уровень гипоксии.

Гидратируйте газ, пропустив его через пузырьковую колбу, наполненную деионизированной водой. Подключите гидратированный газ к камере гипоксии и поместите в нее испытуемые образцы, чтобы подвергнуть их воздействию гипоксических условий. Получены результаты, которые показывают Hi F1-зависимую эмбриональную летальность при гипоксии на основе наблюдения за жизнеспособностью до взрослого возраста.

Основное преимущество этой технологии перед существующими методами, такими как перчаточные ящики, заключается в том, что она проста и недорога в изготовлении в лаборатории и обеспечивает точную и воспроизводимую концентрацию газов в климатической камере. Хотя этот метод дает представление о гипоксической реакции у нематоды С, он также может быть адаптирован к другим системам, включая более крупные модельные организмы и клеточные культуры. Кроме того, его можно использовать для изучения других газов, в том числе углекислого газа и сероводорода.

Этот протокол демонстрирует, как построить камеру гипоксии. Газ хранится в баллонах со сжатым газом с определенной концентрацией кислорода, и к нему прикреплен двухступенчатый регулятор. Газ поступает в нижнюю часть проточной трубы, выходя из верхней с правильным расходом.

Затем газ поступает в пузырьковую колбу, гидратируя газ. Затем гидрогаз поступает в камеру гипоксии на впускном клапане, подвергая образцы воздействию гипоксии. В конце концов газ выходит в помещение через вытяжное отверстие, просверленное в камере.

В качестве корпуса климатической камеры можно использовать чашку для кристаллизации Pyrex или в коробке со стрелками. Объем емкости должен быть сведен к минимуму, а материал должен быть непроницаемым для газа. Просверлите отверстие с одной стороны емкости с карбоновым или алмазным наконечником, просверлите и подгоните с помощью пластикового штуцера для шланга.

Смешайте эпоксидную смолу перед нанесением на коробку и примеркой. Затем повторите ту же процедуру на противоположной стороне контейнера со смещением второго отверстия от первого. Чтобы увеличить турбулентное перемешивание, используйте внешний диаметр одной восьмой дюйма, FEP или нейлоновую трубку для подключения баллонов со сжатым газом к устройству управления потоком, такому как регулятор массового расхода или роторный измеритель.

Газовые баллоны должны иметь определенную концентрацию кислорода, сбалансированную с азотом, которая соответствует сертифицированному стандарту по содержанию кислорода или для бескислородных условий. Для чистого азота используется двухступенчатый регулятор со второй ступенью, установленной на нужное давление. Ознакомьтесь с инструкциями в письменном протоколе по выбору подходящего расхода.

Затем подсоедините трубку от двухступенчатого регулятора к проточной трубе, которая контролирует расход газа, поступающего в камеру. Выходы проточной трубы подключены к газовой промывочной машине с фриттированным баллоном, содержащим дистиллированную воду. Затем подсоедините трубку с другой стороны промывочной бутылки к одному из фитингов на климатической камере.

Это приведет к гидратации газа, поступающего в экологическую камеру. Используйте вакуумную смазку для герметизации камеры. Затем поместите грузы на крышку камеры, чтобы обеспечить герметичное уплотнение.

Проверьте уплотнение, поднеся небольшое количество воды ладонью в перчатке к штуцеру для отвода газов в камере и проверив наличие пузырьков. Во-первых, генерируем синхронизированные популяции морского Элгана. Поместите от одного до 100 г взрослой особи в каплю раствора щелочного отбеливателя на поверхность незасеянной нематоды питательной среды.

Дайте раствору отбеливателя впитаться в планшет после инкубационного периода продолжительностью не менее восьми часов. Перенесите синхронизированных личинок L one в тарелку, засеянную живыми бактериями OP 50. В качестве альтернативы позвольте взрослым особям GRA отложить яйца на тарелку в течение двух-трех часов, чтобы создать группу червей, которые будут развиваться синхронно, или выбрать L четыре личинки из смешанной популяции для сбора молодых эмбрионов.

На стадии от двух до четырех клеток используйте бритвенное лезвие, чтобы измельчить взрослых особей GR в небольшом объеме воды, а затем перенесите эмбрионы с помощью пипетки для рта перед переносом червей на планшет для воздействия в гипоксических условиях. Поместите по краю пластин кольцо из 10 миллиграмм на миллилитр пальмитиновой кислоты в этаноле. Для предотвращения побега червей с поверхности агаровой пластины.

Пальмитиновая кислота выйдет из раствора. По мере того, как этанол испаряется, образуя физический барьер для обеспечения однородности, обязательно замените воду в газовой промывочной бутылке перед экспозицией в камере окружающей среды. После переноса червей на пластины запечатайте пластины в климатической камере, инициируйте поток газа и поддерживайте выдержку в течение желаемого времени для анализа.

Чтобы эмбрионы стали жизнеспособными во взрослом возрасте, дайте червям развиться через 48 часов после возвращения в комнатный воздух, в этот момент они должны быть. Личинки четвертой стадии или однодневные взрослые особи оцениваются на жизнеспособность до взрослой жизни. Чтобы визуализировать гипоксическое воздействие червей, перенесите червей в каплю М 9 на 22-миллиметровую квадратную крышку и при необходимости переверните на прокладку с концентрацией 2% в М 9.

В качестве обезболивающего средства можно использовать 25 миллимоляров амола или 10 миллимолярных азидов натрия. В качестве альтернативы, после воздействия гипоксии, прозрачная климатическая камера может быть размещена непосредственно на сцене препарирующего эндоскопа. Показаны два представления, одно из которых включает в себя всю настройку потока газа.

Другой — только камерой на предметном столике микроскопа. Выращивайте двух червей Bristol N на четырех 10-сантиметровых пластинах высотой до тех пор, пока большинство червей не станут взрослыми особями. Промойте червей в коническую трубку объемом 15 миллилитров с раствором щелочной извести от одного до пяти литров и инкубируйте с вращением, пока черви не начнут растворяться.

Не более пяти минут. Промойте червей три раза с помощью M 9, отжимаясь в 1 500 раз G между каждым промывкой, без ломающейся пластины. Обесцвеченные эмбрионы помещаются на 8 150-миллиметровых пластинах NGM и позволяют эмбрионам развиваться в L-четыре личинки в течение примерно 48 часов.

При температуре 22 градуса Цельсия переместите пластины в климатическую камеру и подвергните воздействию гипоксических и бескислородных условий в течение четырех часов или в течение срока, указанного в экспериментальном плане. Для забора образцов быстро снимают крышку в гипоксическую камеру. Возьмите одну пластину с образцом и повторно запечатайте камеру, время и запишите шаги.

После выведения глистов из гипоксии, весь этот процесс должен занять не более двух минут. Используйте дистиллированную воду, чтобы промыть червей на нейлоновом фильтре, а затем налейте в промаркированную коническую пробирку объемом 15 миллилитров, содержащую 100 микролитров центрифуги 1% SDS. Количество червей в SDS в настольной центрифуге в 1,500 раз больше G в течение 15–20 секунд.

С помощью вакуума удалите большую часть супината из трубки, оставив гранулу червя нетронутой. С помощью пипетки переложите гранулу червя с заданным объемом жидкости в промаркированную пробирку для мусора объемом 1,5 микроконтейнера. Если образец будет использоваться для страницы SDS, то эта пробирка может содержать равный объем двукратной загрузки белка красителем, герметизировать пробирку и погрузить в жидкий азот.

Повторяйте до тех пор, пока не будут выделены все образцы. Следуйте этим процедурам для контрольных проб воздуха в помещении: для консистенции образцы могут храниться при температуре минус 20 градусов Цельсия. Этот рисунок показывает жизнеспособность эмбрионов, подвергшихся воздействию 1000 частей на миллион кислорода, 5000 частей на миллион кислорода и нормоксии около 210 000 частей на миллион кислорода.

Эмбрионы подвергаются воздействию всех условий в течение 24 часов в кислородных камерах непрерывного потока. Червей переводили в нормоксические условия, давали развиться до взрослого возраста в течение 48 часов, а затем оценивали на жизнеспособность до взрослого состояния. После этой процедуры образцы могут быть собраны для последующего анализа с помощью вестерн-блоттинга, QPCR или физиологических анализов, таких как продолжительность жизни или производство потомства.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как настроить камеру непрерывного действия для гипоксии в вашей собственной лаборатории.