In Vitro Анализ PDZ-зависимый CFTR высокомолекулярных комплексов сигнализации

Общая цель данной процедуры заключается в сборке макромолекулярного сигнального комплекса регулятора трансмембранной проводимости муковисцидоза (CFTR), зависящего от PDZ, in vitro. Для этого рекомбинантные меченые слитые белки экспрессируют в бактериях и очищают. Затем получают клеточные лизаты из культур, экспрессирующих CFTR или CFTR-связывающие белки.

Затем CFTR и связывающие белки объединяют in vitro для сборки макромолекулярного сигнального комплекса, содержащего CFTR. Далее проводят вестерн-блоттинг, который подтверждает образование макромолекулярных комплексов CFTR, после чего результаты анализируют. Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими способами является возможность прямого обнаружения и визуализации формирования отдельного высокобелкового макромолекулярного комплекса, содержащего CFTR.

Таким образом, данный метод позволяет получить представление о формировании макромолекулярного комплекса, содержащего CT R. Он также может быть применен для сборки белковых комплексов, не связанных с CFTR, таких как макромолекулярный сигнальный комплекс sex C two. Совсем недавно с помощью этого же метода мы продемонстрировали, что хеморецептор CXCR two физически образует белковый комплекс с нижележащим эффектором.

С помощью ПЦР амплифицируйте ДНК, кодирующую последние 50–100 аминокислот, содержащих PDZ-мотивы на C-конце, для бета-3 адренорецептора, транспортера цАМФ MRP4 и PDZ1-домена регуляторного фактора натрий-водородного обменника NHERF.

Затем клонируйте продукты ПЦР RP4 в вектор pGEX-4T1 для получения слиянных белков GST и PDZ1-домен NHERF в вектор pET-30. Для получения слиянных белков с His-тегом трансформируйте бактерии методом теплового шока. Культуру штамма E. coli с дефицитом протеаз выращивайте в течение ночи при 37 °C в шейкере в 50 мл среды LB с добавлением соответствующих вектору антибиотиков в среде SOC.

На следующий день разведите культуру в соотношении 1:10 в 500 миллилитрах среды Luria berti, затем снова инкубируйте культуру при перемешивании при 37 °C в течение двух часов. Индуцируйте транскрипцию рекомбинантного белка с помощью 0,5–1 мМ IPTG в течение четырех часов при 30 °C.

После инкубации перенесите культуры в центрифужные пробирки объемом 250 мл и осадите клетки путем центрифугирования при 8, 000 ×g в течение 10 минут при температуре 4 °C. После центрифугирования удалите супернатант и добавьте 20 мл сахарозного буфера, содержащего лизоцим в концентрации 1 мг/мл, 0,2% Triton X 100 и ингибиторы протеаз для лизиса клеток; затем перенесите бактериальную суспензию в чистую центрифужную пробирку объемом 50 мл.

Перемешивайте на ротационном шейкере в течение 30 минут при температуре 4 °C. Затем центрифугируйте при 20 000 ×g в течение 30 минут при температуре 4 °C. После центрифугирования супернатант станет прозрачным, а на дне пробирки образуется осадок нерастворимых белков.

Соберите прозрачный супернатант в новую коническую пробирку объемом 50 мл. Затем добавьте в супернатант один миллилитр соответствующей смолы. Aero beads в виде 50% суспензии в сукрозном буфере с глутатионом.

Для белков с GST-слиянием следует использовать Aero-beads, а для белков с His-S-слиянием — talon-beads. Перемешивайте в течение четырех часов при температуре 4 °C на ротационном шейкере. Затем центрифугируйте сорбент при 800 ×g в течение двух минут.

Затем промойте их, ресуспендировав в 15 миллилитрах PBS, и перемешайте на ротаторе в течение двух минут. В завершение удалите супернатант. Повторите данную процедуру шесть раз; после шестого промывания.

Чтобы элюировать белок из гранул, добавьте два миллилитра соответствующего элюирующего буфера на каждый один миллилитр гранул и перемешивайте в течение 10 минут при комнатной температуре. Перелейте весь элюат вместе с гранулами в колонку и соберите прошедшую жидкость как элюированный белок. Затем перенесите белок UD в диализную трубку.

Диализируйте элюированные белки против двух литров PBS при перемешивании при температуре 4 °C. Заменяйте PBS каждые четыре часа в течение четырех циклов после диализа. Сконцентрируйте белок до объема от 0,5 до 1 мл.

Используйте центрифужный фильтр с пределом отсечения 10 000 Da. Разделите образец на аликвоты по 200 µL каждая. Одну аликвоту оставьте для анализа, остальные поместите при температуре -80 °C для хранения.

Определите концентрацию белка методом Брэдфорда. Оцените качество белка с помощью SDS-PAGE, используя стандарты BSAS. Если целостность белка окажется неудовлетворительной, могут быть применены процедуры вторичной очистки, такие как гель-фильтрация или ионный обмен.

Клетки HEK 293, экспрессирующие CFTR дикого типа с флаг-тегом, следует культивировать согласно описанию в прилагаемом документе. Удалите среду из лунок и промойте клетки раствором PBS. Затем для лизиса клеток добавьте 500 µL лизирующего буфера на каждую чашку Петри диаметром 60 мм и перемешивайте клеточные лизаты в течение 20 минут при температуре 4 °C.

Перенесите лизаты в новые микроцентрифужные пробирки. Затем для удаления нерастворимых белков центрифугируйте образцы при 16,000 ×g в течение 15 минут при температуре 4 °C и соберите супернатанты. Определите концентрацию белка с помощью метода Брэдфорда для сборки макромолекулярных комплексов, содержащих CFTR, in vitro.

Начните с объединения 20 µg очищенного слитного белка G-S-T-M-R-P four (C-терминальный участок из 50 аминокислот) и возрастающих количеств очищенного слитного белка hiss S PD zk one в диапазоне от 0 до 40 µg в 200 µl лизирующего буфера в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл. Перемешивайте два белка на роторном миксере при 22 °C в течение одного-двух часов. Затем добавьте 20 µl 50%-ной суспензии глютатион-бусин в белковую смесь и продолжайте перемешивание еще в течение одного часа.

Этот этап также называют попарным связыванием, при котором G-S-T-M-R-P four CT 50 связывается с SPD zk one. В это время подготовьте лизаты клеток HEK 2 93 с гиперэкспрессией CFTR дикого типа с меткой flag, как описано в предыдущем разделе видео, после этапа попарного связываемого. Промойте комплекс дважды лизис-буфером, центрифугируя при 800 ×g в течение одной минуты при каждой промывке, и аккуратно аспирируйте супернатант после каждой промывки.

Будьте осторожны, чтобы не аспирировать гранулы со дна. Добавьте лизаты клеток HT K 2 93 к гранулам и аккуратно перемешивайте на ротационном миксере при температуре four degree Celsius в течение трех часов или в течение ночи после инкубации. Промойте гранулы трижды лизисным буфером, центрифугируя после каждой промывки, как и до последней промывки.

Для элюции белков добавьте 30 µL пятикратного буфера для образцов и инкубируйте на водяной бане при 37 °C в течение 10–15 минут. Затем центрифугируйте при 5 000 ×g в течение одной минуты для осаждения бусин. Далее нанесите весь элюат на гель для SDS-PAGE с градиентом 4–15% и проводите электрофорез при 200 В до конца геля. После завершения разделения перенесите белковые полосы на ПВДФ-мембрану в течение 1,5 часов при 60 В с помощью аппарата для переноса BioRad.

После завершения переноса блокируйте мембрану в растворе TBS tween с добавлением 5% обезжиренного молока в течение одного часа. Выполните вестерн-блоттинг согласно описанию в прилагаемом документе для визуализации белков, взаимодействующих с CFTR. Макромолекулярный сигнальный комплекс, содержащий A-C-F-T-R, был собран in vitro, как описано в данном видео и показано на этой схеме.

Макромолекулярный комплекс, образованный между 50 аминокислотами C-конца Mr.RRP four PD zk one и полноразмерным CFTR, для определения дозозависимости формирования макромолекулярного комплекса. В соответствии с представленной схемой добавляли увеличивающиеся количества промежуточного белка PD ZK one. Количество комплекса увеличивалось дозозависимым образом, что свидетельствует о том, что промежуточный белок PD ZK one опосредует взаимодействие между CCF TR и Mr.Rrp four.

При выполнении данной процедуры важно помнить, что образцы микромолекулярных комплексов FTR, подготовленные для вестерн-блоттинга, нельзя кипятить, так как агрегация FTR является распространенной проблемой. Вместо этого образцы следует нагревать при 37 °C в течение 10–15 минут перед нанесением на гель согласно данной методике. Для оценки эндогенных комплексов CFTR в таких клетках, как эпителиальные клетки дыхательных путей и эпителиальные клетки кишечника, могут быть использованы другие методы, например, коиммунопреципитация.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как собрать в условиях in vitro макромолекулярный сигнальный комплекс CFDR, зависящий от PTC.