C. Элеганс отслеживания и поведенческих измерений

Фенотипирование. Локомоция C. elegans является важным инструментом для поиска генов и нейронов, участвующих в поведении C. elegans. C. elegans демонстрируют стереотипные двигательные реакции, такие как движение вперед и назад, а также различные типы поворотов за счет изменения формы тела. Чтобы количественно оценить эти перемещения на больших расстояниях с высоким пространственным и временным разрешением, мы создали трекер червей для фиксации движений C. elegans при перемещении по поверхности агаровой пластинки.

Мы также разработали программное обеспечение для изоляции и количественного анализа этих движений с помощью специализированных программ, написанных в LabVIEW и MATLAB. Сложность всех систем видеотрекинга заключается в том, что они генерируют огромный объем многомерных данных. Наша программа обработки изображений и анализа данных решает эту задачу путем сведения форм червя к набору независимых компонентов; таким образом мы смогли всесторонне реконструировать поведение червя как функцию всего от трех-четырех измерений.

Чашка с агаром освещается волоконным источником света и снимается на камеру. Эта система установлена на XY-трансляционном столике. Столик перемещается стандартными шаговыми двигателями, которые подключены к контроллеру шаговых двигателей.

Контроллер и камера подключены к компьютеру и управляются специальными программами, написанными в LabVIEW. Камера фиксирует изображение поверхности агаровой пластинки и идентифицирует темные объекты на светлом фоне. Калибровочная метка для процесса автоматической калибровки создается путем прокалывания поверхности агара.

С помощью инструмента для захвата червей настраивается качество изображения таким образом, чтобы компьютерная программа могла количественно оценивать объекты в режиме реального времени. Для получения темного объекта на белом фоне можно отрегулировать усиление, яркость и скорость затвора камеры. Также можно проверить отфильтрованное бинарное изображение, используемое программой отслеживания.

Программное обеспечение имеет функцию автокалибровки, которая вычисляет калибровочную матрицу путем перемещения тестового объекта на фиксированное расстояние. С помощью этой калибровочной матрицы расстояние в пикселях приводится в соответствие с шагами шагового двигателя.

После калибровки система готова к работе и не требует повторной калибровки, если не изменяется увеличение или положение камеры. Для удержания червей и предотвращения их перемещения к краю планшета будет использоваться медное кольцо. Сначала нагрейте кольцо, поместив его на термоблок или аналогичное устройство.

Кольцо следует нагревать примерно одну минуту. Поместите кольцо на свежую чашку с агаром и слегка нажмите, чтобы оно погрузилось в поверхность агара. Для очистки червей на стадии L4 и молодых взрослых особей от остатков пищи будет использоваться чашка с агаром, заполненная буфером NGM.

После переноса червей в NGM-буфер дайте им поплавать в течение нескольких минут. Осторожно поместите одного из промытых червей на трекинг-пластину недалеко от центра кольца. Эта пластина в дальнейшем будет использоваться для трекера червей.

Поместите подготовленный планшет на платформу трекера для червей. Запустите программу LabVIEW и при необходимости выберите параметры, такие как путь для сохранения изображений, типы изображений, измеряемые показатели и настройки камеры. С помощью джойстика перемещайте микроскоп до тех пор, пока изображение червя не появится в поле зрения на экране компьютера.

Затем нажмите кнопку track, чтобы запустить программу трекинга. Здесь мы демонстрируем отслеживание червя в режиме реального времени. Компьютерная программа измеряет перемещения на бинарно-фильтрованных изображениях, как показано на экране, и может проводить измерения этого изображения в режиме реального времени.

После отслеживания можно реконструировать глобальную траекторию на основе движений шагового двигателя, в то время как локальные изменения формы червя можно рассмотреть детально. Черви ползают, совершая волнообразные движения. Мы фиксируем эти движения, представляя червя в виде скелетизированной центральной кривой, а затем описывая эту кривую как набор углов.

Затем мы разлагаем скелеты на их основные формы, также известные как собственные векторы. С помощью этих собственных мод мы можем восстановить форму червя и количественно оценить его движения. Используя первые две моды, мы можем точно определить фазовое положение ундуляционного цикла червя, как показано на второй панели.

На первой панели показано совместное распределение первой и второй мод, демонстрирующее круговой предельный цикл. Фазовое движение в одном направлении соответствует движению вперед, а фазовое движение в противоположном направлении — движению назад. Таким образом, фазовая скорость соответствует скорости червя.

В реальном пространстве сильная корреляция фазы и фактической скорости видна на последней панели. Используя фазовую скорость, полученную из собственной моды, мы можем выявить некоторые тонкие детали элегантного поведения морских червей, которые были бы незаметны при обычном визуальном наблюдении. Например, совместное распределение фазовой скорости и фазы четко указывает на то, что черви покидают состояние движения вперед и возвращаются в него преимущественно на определенных фазах движения.

В данной работе мы продемонстрировали простую в использовании систему трекинга, которая регистрирует детальные изображения поведения C. elegans при перемещении по поверхности и по планшетам с агарозным слоем (ACA). Объем информации, содержащийся в этих изображениях, огромен и многомерен, поэтому мы также разработали метод снижения размерности данных до четырех основных показателей. Эти показатели легко интерпретировать с точки зрения поведения червя.

Данная работа создана для измерения поведения червей при минимальных модификациях; система также может быть использована для измерения нейронной активности с помощью генетически кодируемых областей. Система в целом обладает гибкостью конструкции и может быть использована с другими системами перемещения, такими как Doof law, LOEs.