Моделирование колит, связанного с раком Azoxymethane (ОСО) и декстран сульфат натрия (DSS)

В нулевой день мышам вводили азоксиметан или ОМ на следующей неделе. Их питьевую воду заменяли раствором, содержащим декстрансульфат натрия или DSS. На третьей неделе мышам предоставляли обычную воду на следующие две недели.

Этот цикл введения DSS с последующим периодом восстановления водой повторяют еще два раза. После второго цикла DSS можно провести оценку наличия опухолей у мышей с помощью зеркальной эндоскопии.

После 10-й недели мышей подвергают эвтаназии и извлекают ободочную кишку. Ободочную кишку промывают и вскрывают продольным разрезом. Проводится оценка размера и количества опухолей в ободочной кишке.

Продольный срез толстой кишки, разделенный на три части, можно залить в парафин и направить на гистологический анализ. С помощью световой микроскопии можно подсчитать количество опухолей и классифицировать их. Мы демонстрируем протокол, включающий введение генотоксического агента OM с последующими тремя циклами применения провоспалительного агента.

DSS быстро и стабильно вызывает образование опухолей толстой кишки у мышей, которые морфологически и молекулярно схожи с опухолями при колоректальном раке, ассоциированном с колитом у человека. В день 0 индивидуально пометьте каждую мышь с помощью меток на хвосте или надрезов на ушах, зафиксируйте в таблице исходную массу тела каждой мыши, затем введите каждой мыши раствор OM в дозе 10 mg/kg. Соблюдайте осторожность при работе с OM, так как это генотоксичный агент. На седьмой день обеспечьте мышей питьевой водой с 2,5% раствором DSS на следующую неделю. Для приготовления данного раствора добавьте порошок DSS в дистиллированную воду и перемешивайте до полного растворения.

Раствор готов после фильтрации через целлюлозоацетатный фильтр с порами 0,2 мкм. Для обеспечения непрерывной подачи раствора DSS в течение семи дней заменяйте DSS каждые два-три дня.

По истечении этого периода верните мышей в клетки с водой на две недели. Взвешивайте мышей два-три раза в неделю и наблюдайте за наличием диареи и ректального кровотечения. У мышей с крупными опухолями может временно развиться выпадение прямой кишки, хотя это обычно не снижает процент выживаемости.

Потеря веса относительно исходного уровня используется в качестве суррогатного показателя тяжести колита. В течение недели после полного цикла введения DSS ожидается потеря веса до 10% в сочетании с диареей и ректальным кровотечением на протяжении двух-трех дней. Для подтверждения роста опухоли in vivo перед забиванием животных может быть проведен второй или третий цикл DSS.

Поскольку модель A-O-M-D-S-S достаточно надежна в плане индукции опухолей, этот этап обычно не требуется. С помощью данного метода следует оценивать лишь нескольких мышей, так как он может привести к повреждению опухолей. В вашей рабочей зоне должны находиться стакан с инертным стерильным фосфатно-солевым буфером (PBS), а также пустой стакан.

Для удаления использованного PBS наберите от 8 до 10 миллилитров PBS в шприц и подсоедините его к эндоскопу перед каждым использованием. При промывании внутрипросветного содержимого анестезируйте каждую мышь с помощью ингаляционной или инъекционной седации и зафиксируйте мышь на плоской доске с помощью скотча за хвост и грудь; подушечки лап мыши можно зажать. Чтобы убедиться в адекватности седации, используйте большой и указательный пальцы, чтобы сжать нижнюю часть живота мыши и обнажить анус, после чего введите эндоскоп muren в прямую кишку мыши.

Осторожно используйте PBS для раздувания и промывания, чтобы улучшить обзор просвета кишечника и удалить фекальное содержимое. Продолжайте медленно продвигать эндоскоп, наблюдая за монитором. К 70-му дню у каждой мыши, получавшей A-O-M-D-S-S, должны присутствовать выраженные опухоли в толстой кишке, готовые к оценке.

Этот этап можно отложить на несколько недель или месяцев, если требуются более крупные опухоли. Подготовьте шприц, заполненный PBS, с установленной иглой для зондового кормления. Шприц, заполненный 10% формалином, базовые хирургические ножницы, ножницы с закругленными концами.

Небольшой шприц, заполненный 1% раствором Ian Blue, и тонкий пинцет. Также подготовьте охлажденный лоток, емкость с охлажденным PBSA, новое лезвие для секционирования и фиксирующую ванночку, заполненную 10% формалином. Эвтаназируйте каждую мышь с помощью изофлурана и цервикального вывиха или другого одобренного учреждением метода. Можно произвести окончательное взвешивание и другие измерения.

Теперь положите мышь на разделочную доску брюшной стороной вверх. Опрыскайте живот 70% ethanol, чтобы шерсть не попадала в область диссекции. С помощью пинцета захватите кожу по средней линии живота и сделайте небольшой разрез, чтобы обнажить брюшину.

Осторожно потяните кожу, чтобы отделить её от брюшины и обнажить всю брюшную полость. Сделайте разрез брюшины и extending продлите его вдоль реберных краев с обеих сторон. Используя закрытые ножницы, отодвиньте тонкий кишечник и ободочную кишку в сторону.

Это позволит обнажить брыжеечные лимфатические узлы, которые при необходимости можно извлечь. Для оценки сместите мочеполовой тракт каудально, чтобы обнажить нисходящую часть ободочной кишки и прямую кишку, и иссеките мочевой пузырь и репродуктивные органы, если это необходимо для дальнейшего обнажения области таза, стараясь не повредить прилегающие ткани.

Перережьте нижнюю и верхнюю ветви лобковой кости, чтобы обнажить место соединения анального канала и прямой кишки. Разрежьте кожу вокруг этого соединения, чтобы освободить ободочную кишку, при этом осторожно потягивая ее вверх. С помощью мезентериальных щипцов можно иссечь или аккуратно отделить прикрепления ободочной кишки.

Важно сохранить часть кожи в области перехода анального канала в прямую кишку, так как эта область часто поражается дисплазией. Пересеките толстую кишку в месте ее соединения с тонкой кишкой проксимальнее слепой кишки. Отделите слепую кишку от прилегающей части ободочной кишки, используя зондовую иглу 18-го калибра, прикрепленную к шприцу объемом 5 мл.

Промойте ободочную кишку ледяным PBS так, чтобы жидкость выходила в физиологическом направлении, используя ножницы с закругленными концами. Раскройте ободочную кишку вдоль брыжейки. Разложите вскрытую кишку на холодном лотке.

Убедитесь, что лоток достаточно оттаял, чтобы не заморозить ткань. Для лучшей визуализации опухолей нанесите несколько капель 1% Ian Blue с помощью пальца. Оцените количество и размер опухолей с помощью линейки или сделайте фотографии для последующего цифрового анализа.

На данном этапе можно иссечь небольшие фрагменты опухоли с прилегающей нормальной тканью для последующего анализа методами исследования РНК, белков или иммуногистохимическими методами, оставив часть ободочной кишки для гистологической оценки. С помощью шприца или пальца нанесите 10% формалин на оставшуюся часть ободочной кишки на холодном подносе, оставив ткань фиксироваться минимум на 30 секунд. Это облегчит перенос образца в емкость для фиксации.

Убедитесь, что остатки формалина удалены перед окрашиванием новой вскрытой толстой кишки на том же поддоне. Перенесите толстую кишку в кювету, наполненную 10% формалином, и закрепите её по краям булавками. Через три часа фиксации удалите формалин и замените его 70% этанолом.

Ободочные кишки можно хранить в 70% ethanol неопределенный срок. При слабом нагреве приготовьте 2% раствор agar и поместите чистое предметное стекло на стеклянную пластину. Разрежьте фиксированную ободочную кишку на три части, а неиспользованные фрагменты верните в емкость с ethanol.

Обрежьте участки до одинакового размера с помощью двух лезвий. Поместите срезы и слои толстой кишки в агар на чистом предметном стекле. Повторите этот процесс для следующего участка толстой кишки.

Отрежьте сегменты, удалите излишки агара и поместите имплантированную ободочную кишку в кассету для дальнейшей обработки и окрашивания гематилином и эозином. На рисунке 1 представлена схема протокола индукции рака, ассоциированного с колитом. На рисунке 2 показана динамика массы тела мышей относительно исходного уровня в период введения OM и DSS.

Обратите внимание, что в течение недели после каждого цикла введения DSS мыши теряют от 5 до 10% массы тела. Потеря веса в данном эксперименте служит суррогатным маркером тяжести колита. На рисунке 3 представлен вид опухолей в дистальном отделе ободочной кишки, полученный с помощью эндоскопии мышей на 50-й день терапии A-O-M-D-S-S.

Обратите внимание на множественные полипоидные образования, обтурирующие просвет дистального отдела ободочной кишки на панелях B и C, по сравнению с нормальной ободочной кишкой. На панели A рисунка 4 представлена продольно вскрытая ободочная кишка мыши, демонстрирующая макроскопический вид опухолей. Отметьте более высокую опухолевую нагрузку в дистальном отделе и характерную текстуру проксимального отдела ободочной кишки с незначительным ростом опухолей.

На рисунке 5 представлены опухоли, выделенные с помощью красителя lc и синего красителя. Обратите внимание, как краситель подчеркивает нормальную текстуру толстой кишки, а также границы каждой отдельной опухоли. Такое окрашивание может быть полезным для точного измерения площади опухолей с помощью линейки или цифрового метода измерения.

На рисунке 6 показано типичное распределение среднего количества опухолей на одну мышь, получавшую OM и DSS. Обратите внимание, что большинство опухолей расположены в дистальном отделе толстой кишки и имеют размер менее 2 мм. На рисунке 7 представлены продольные срезы толстой кишки, залитые в парафин и помещенные в кассету, а также предметное стекло с окрашиванием гематоксилином и эозином.

Обратите внимание, что остаточное окрашивание S и синий краситель не препятствуют окрашиванию гематоксилином и эозином. Большая опухоль обведена кружком на изображении препарата. Обозначения «дистальный», «средний» и «проксимальный» получены в результате разделения всей толстой кишки на три части в промежутке между слепой кишкой и анусом.

На рисунке 8 представлен типичный гистологический срез опухоли в дистальном отделе ободочной кишки, возникшей в результате введения OM и DSS. Представленные микрофотографии окрашены H и E-B-R-D-U, а также на бета-катенин; они демонстрируют диспластические изменения, сходные с аденокарциномой толстой кишки у человека. В данном видео мы продемонстрировали протокол индуцированного воспалением колоректального туморогенеза у мышей с использованием однократной инъекции OM с последующими тремя семидневными циклами введения DSS.

В течение 10 недель в данной модели индуцируются опухоли с гистологическими и молекулярными изменениями, которые тесно напоминают изменения, происходящие при колоректальном раке, ассоциированном с колитом у человека, что представляет собой высокоценную модель для изучения онкогенеза и химиопрофилактики этого заболевания.