Мышь Островок Лангерганса изоляции с использованием комбинации Очищенный коллагеназы и нейтральной протеазы

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы успешно изолировать глазки от поджелудочной железы мыши. Это достигается путем первичной изоляции поджелудочной железы от окружающих тканей. Затем желчный проток канюлируют, чтобы поджелудочную железу можно было накачать смесью протеаз коллагеназы.

После надувания поджелудочная железа удаляется, а люверсы осторожно диссоциируются. Наконец, изолированные люверсы фильтруются и покрываются для использования в будущем. В конечном счете, этот метод выделения глазков с помощью очищенной коллагеназы и нейтральной протеазы используется для получения максимального выхода глазков и оптимальной морфологии глазков.

Основное преимущество этой методики перед существующими методами выделения глазков заключается в том, что мы устранили вариабельность от партии к партии за счет использования очищенных ферментов. Кроме того, мы изменили или улучшили некоторые протоколы для улучшения морфологии глазков. После усыпления накройте туловище 70% этанолом до полного раскрытия брюшной полости от ануса до диафрагмы.

Далее поместите мышку на платформу для диссекционного микроскопа. Вытащите слепую кишку и восходящую ободочную кишку и выведите их за пределы полости тела влево, сместите доли печени относительно диафрагмы. Если они не остаются там самостоятельно, увеличьте отверстие полости тела.

Захватите двенадцатиперстную кишку изогнутыми щипцами и найдите воротную вену печеночной артерии и пучок желчных протоков, ведущих к печени. С помощью еще одной пары изогнутых щипцов. Наложите шов под пучок артериальной вены и протока и затяните его как можно ближе к печени.

С помощью двух пар изогнутых щипцов осторожно захватите двенадцатиперстную кишку и найдите прикрепленный желчный проток У сосочка с помощью одного щипца проткните поджелудочную железу и соединительную ткань прямо под желчным протоком и рядом с рабочим сосочком. Быстро поместите щипцы через отверстие и вставьте шов. Свободно. Завяжите шов вокруг желчного протока, чтобы создать небольшой круг с помощью щипцов под углом 90 градусов.

Тяните тонкую кишку до тех пор, пока желчный проток не станет тау-тау. Сделайте один горизонтальный надрез поперек сосочка очень тонкими ножницами, не вытесняя желчный проток из сосочка, удерживая кишечник. Вставьте канюлю в желчный проток, а затем аккуратно натяните шов вокруг канюли.

Далее наполните трехмиллилитровый шприц 2,0 миллилитрами протеазной смеси коллагеназы. Вводите эту смесь в канюлю в медленном, постоянном темпе. После того, как раздувание поджелудочной железы будет завершено, удалите канюлю из желчного протока.

Начиная с нисходящей ободочной кишки, отрежьте соединительную ткань, одновременно подтягивая кишечник вверх, пока не будет достигнут желчный проток. Далее отделите поджелудочную железу от селезенки и окружающих тканей. Наконец, срежьте швы и удалите поджелудочную железу.

После удаления поместите поджелудочную железу в 50-миллилитровую трубку, содержащую пять миллилитров HBSS на льду. После того, как все образцы будут собраны, поместите любые 50-миллилитровые пробирки, содержащие ткань поджелудочной железы, в водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия. В течение 15 минут осторожно покачивайте трубку и проверяйте наличие диссоциации тканей.

Убедитесь, что ткань легко расходится, удерживая трубку за крышку. Покрутите 12 раз, чтобы еще больше диссоциировать ткань. Добавьте не более 30 миллилитров HBSS и центрифугу.

Осторожно отсадите надосадочную жидкость и оставьте небольшое количество надосадочной жидкости внизу, чтобы не нарушить клеточную палитру. С помощью шприца объемом 30 миллилитров, прикрепленного к игле 14 калибра, добавьте не более 10 миллилитров HBSS и дважды аспирируйте суспензию вверх и вниз. Отфильтруйте клеточную смесь через пластиковый Т-образный фильтр в 50-миллилитровую трубку.

Промойте еще 10 миллилитров, HBSS и центрифугу. Сцедите надосадочную жидкость и переверните трубки для стекания на впитывающее бумажное полотенце в течение одной минуты. Ресуспендируйте каждую трубку по 10 миллилитров.

Холод 1100. Его непрозрачная накладка, его непрозрачная С 10 миллилитров, HBSS и центрифугой. Удалите все 20 миллилитров надосадочной жидкости с помощью пипетки большого диаметра 25 миллилитров и пропустите надосадочную жидкость через перевернутый фильтр 70 микрон.

Отфильтруйте проушины непосредственно в чашке Петри и промойте пипетированием 10 миллилитров фильтрующего материала через фильтрующую культуру. Проушины в инкубаторе для тканевых культур до тех пор, пока они не будут готовы к экспериментам. Выход люверсов, морфология и качество являются общими параметрами, используемыми для оценки успешности выделения люверсов.

Здесь показана типичная морфология люверсов. Люверсы имеют круглую или продолговатую форму с относительно равномерным размером. Здесь. Изолированные глазки анализировали на глюкозостимулированную секрецию инсулина.

Стимуляция инсулином была сходной у глазков, приготовленных Sigma Type 11, по сравнению с ci zyme TM, MABP, что свидетельствовало о высоком качестве подготовки глазков. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как канюлировать желчный проток мыши. Работайте с зим-коллагеназой и нейтропротеазами, чтобы изолировать веки для любого анализа.