Микродиализ этанола в течение оперантного этанола самоуправления и определение этанола методом газовой хроматографии

Общая цель этой процедуры заключается в контроле уровня этанола в диализатом мозга во время сеанса самостоятельного приема этанола. Чтобы сравнить эту меру с синхронным самовведением, это достигается путем хирургической имплантации микродиализного гида, канюли и болта троса, а затем обучения крыс оперирующему самостоятельному введению этанола. Второй шаг заключается в том, чтобы приучить крыс к тросу головной ступени, чтобы он не препятствовал самостоятельному введению этанола во время микродиализа.

Затем проводится микродиализ во время сеанса самостоятельного введения этанола, во время которого подготавливается порция диалата для анализа этанола. Далее образцы диалатов анализируют на концентрацию этанола с помощью газового хроматографа с детектированием пламенной ионизации. В конечном счете, полученные результаты показывают временной ход достижения этанола в интересующей области мозга во время сеанса самостоятельного введения этанола.

Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как пункция хвоста или подкожной вены, заключается в том, что эта процедура минимально нарушает работу во время сбора образца и позволяет измерять лекарственные препараты в интересующей области мозга, пока животное выполняет поведенческую задачу. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что он требует ряда специализированных навыков, многие из которых могут быть приобретены только через повторную практику или опыт. Также процедуру будет демонстрировать Джеффри Дилли, научный сотрудник нашей лаборатории.

Все представленные процедуры для животных одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Техасским университетом и соответствуют всем правилам по уходу и использованию лабораторных животных. Техасский университет в Остине является аккредитованным ALAC учреждением, в котором хорошо обращаются с длинными крысами Эванса, которым хирургическим путем имплантировали канюлю 21 калибра над интересующей областью мозга, используются для этих экспериментов по поведенческому микродиализу. Все животные должны получить по крайней мере одну неделю послеоперационного ухода и восстановления и быть здоровыми перед началом следующих процедур.

Поместите крысу в операционную камеру, оснащенную выдвижным рычагом и трубкой самосвала, и научите ее нажимать на рычаг для доступа к 10% раствору сахарозы. После того, как крыса обучена реагировать на раствор сахарозы, начните ее по соответствующему графику обучения, во время которого этанол постепенно добавляется в раствор в течение нескольких сеансов питья в ночь перед предпоследним оперантным сеансом. После обезболивания животного и проверки уровня седативного эффекта прикрепите пружину страховочного троса к болту страховочного троса на сцене для головы крысы, чтобы приучить его к устройству, состоящему из рычага противовеса, рычага, поворотного троса, пружины и подставки для колец.

Позвольте крысе провести ночь в операционной комнате в домашней клетке с пищей и водой, а затем завершите тренировку на следующий день с помощью троса и сопутствующего оборудования, установленного за день до эксперимента с микродиализом. После обезболивания крысы изофтором проверьте наличие седативного эффекта, выполнив щиплет пальца ноги, и введите микродиализный зонд, перфузированный искусственной спинномозговой жидкостью. Надежно закрепите щуп, а затем отрегулируйте скорость потока щупа до 0,2 микролитра в минуту.

Поместите крысу в ее домашнюю клетку в операционной комнате, чтобы она провела ночь со всем оборудованием для диализа на месте, а также добавьте в нее корм и воду. На следующий день после установки зонда, по крайней мере, за два часа до начала эксперимента, увеличьте скорость зонда до его рабочего потока. С помощью шприца Hamilton убедитесь, что расход зонда постоянен и составляет не менее 90% от заданного расхода.

Если вы оцениваете нейротрансмиттеры в образцах для диализа, отбирайте образцы на всех этапах эксперимента. Начните со сбора образцов для диализа, пока животное находится в домашней клетке. Храните образцы в надлежащем виде для последующего анализа.

Осторожно перенесите крысу в оперантную камеру и запустите оперантную программу, которая управляет камерой. Продолжайте отбирать пробы, пока крыса ждет, пока рычаг протянется в камеру на две пробы, прежде чем рычаг выдвинется. Начните сбор части каждого образца диализата для анализа этанола, введя соответствующую аликвоту диализата в стеклянный флакон объемом два миллилитра, запечатайте флакон герметичной перегородкой, пипеткой и быстро запечатайте образцы этанола.

Поскольку этанол летуч, а объем образца невелик, непоследовательная или медленная подготовка образцов приведет к неточным результатам. Остаток сохраните для анализа нейротрансмиттеров. 20-минутный период питья начинается после того, как компьютерная программа Med Associates протягивает рычаг в камеру, и крыса нажимает на него, чтобы получить доступ к бутылке с питьевым раствором.

Продолжайте отбирать пробы на протяжении всего питьевого периода, после того как компьютерная программа уберет бутылку из камеры. Оставьте животное в камере еще на 20 минут после питья в конце эксперимента с микродиализом. После обезболивания крысы извлеките зонд.

Если животное не будет сразу гуманно усыплено, замените обтератор для обеспечения визуализации зондового тракта. Соберите мозг в течение трех дней после эксперимента. Анализируйте образцы вместе с внешними стандартами этанола с помощью газового хроматографа с пламенно-ионизационным детектором, автоматического пробоотборника, нагретого до 50 градусов Цельсия, и капиллярной колонки с гелием в качестве подвижной фазы.

Для записи и анализа хроматограмм используйте программное обеспечение для хроматографической рабочей станции, чтобы подготовить систему к анализу этанола. Используйте водяную баню с рециркуляцией для нагрева пластины пробоотборника автомобиля и откройте воздушные и водородные баки. Далее запустите программу запуска.

Когда он будет готов, инициируйте 20-минутный ожог, который обеззараживает волокно. Сделайте нормы с помощью мерной колбы объемом 100 миллилитров развести 238 микролитров 95%-ного этанола с водой до конечного объема 100 миллилитров. Используйте разводение последовательных шин «один к одному» для создания стандартов.

Разложите эталоны по стеклянным флаконам и запечатайте их точно так же, как были подготовлены образцы. Обязательно используйте воду в соответствии со своими стандартами. Поместите стандарты и образцы в лоток автоматического пробоотборника и нагревайте их до тех пор, пока вся жидкая аликвота не испарится.

Чтобы запустить стандарты и сэмплы, создайте список образцов, отметив, какой образец находится в каком слоте автоматического пробоотборника, и отметив, что каждый образец должен быть проколот. После этого направьте файлы данных в выбранную папку, выберите метод выборки и начните прогон. После того как система проверит выборки, убедитесь, что программа правильно интегрировала каждый пик.

График, высота пика в зависимости от каждого известного внешнего стандарта. Концентрация этанола. Используйте линейную функцию, заданную точками, для интерполяции концентрации этанола в каждом образце диализата.

На этом рисунке показаны примеры хроматограмм для трех концентраций стандартного этанола и одной для образца диализата крыс, собранного в конце сеанса самостоятельного введения этанола. Пики этанола должны быть относительно симметричными, иметь постоянное время удержания и отношение сигнал/шум более 10. Несоответствие этим критериям означает, что система требует технического обслуживания, качественной хроматографии и правильного построения линейной стандартной кривой, которая используется для расчета концентрации этанола в образцах диализата, собранных у животных, самостоятельно вводящих этанол, в ходе их самостоятельного введения.

Полученные концентрации диализата этанола не корректируются на восстановление зонда in vivo и составляют лишь часть концентрации этанола в тканях мозга. Если требуется количественный микродиализ этанола, экспериментально определяют экстракционную фракцию этанола, которая диффундирует из внеклеточного пространства в зонд. После освоения этой техники ее можно выполнить примерно за четыре-пять часов, если она выполнена правильно.

Это будет варьироваться в зависимости от продолжительности поведенческого сеанса. Успешное завершение микродиализной фазы эксперимента во многом зависит от качества подготовительных фаз. При попытке выполнить эту процедуру важно убедиться, что с вашими крысами хорошо обращаются и что вы приучили их к любым отвлекающим раздражителям, которые могут возникнуть во время эксперимента с диализом, чтобы это не повлияло на поведение животного при самостоятельном введении крови.