Постоянное давление контролируемый методом экструзии для приготовления наноразмерных липидных везикул

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы представить надежный метод получения биологически значимых липидных везикул. Это достигается путем смешивания и переноса фосфолипидов в стеклянные флаконы и их увлажнения водным буфером для создания многослойной суспензии СКВ. В качестве второго шага выполняется метод замораживания и размораживания, который впоследствии приводит к получению везикул Ella из пузырьков с несколькими пластинками.

Далее липосомальную суспензию пропускают через экструдер с использованием определенного оптимального давления для получения однородных липидных везикул желаемого размера. Были получены результаты, которые показывают постоянные субмикронные размеры везикул на основе динамического рассеяния света и анализа отслеживания наночастиц. Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как ультразвуковая обработка и осаждение, заключается в том, что в этом методе используется система контроля давления с оптимальными значениями расхода азота для эффективного приготовления размера липидных везикул.

Чтобы начать эту процедуру, достаньте стеклянный флакон объемом 20 миллилитров с крышкой с тефлоновой футеровкой, очистите всю стеклянную посуду и шприцы хлороформом перед использованием, чтобы предотвратить загрязнение. Перенесите 100 микролитров реагентного хлороформа в стеклянный флакон с помощью герметичного стеклянного шприца объемом 250 микролитров. Добавьте 30 микролитров реагентного метанола в тот же стеклянный флакон с помощью герметичного стеклянного шприца объемом 100 микролитров.

Приготовьте двухмиллимолярный раствор холестерина мака С, переведя 216 микролитров по 10 мг на миллилитр С на 42 микролитра по 10 мг на миллилитр. Выпячивайте и 20 микролитров по 11 миллиграмм на миллилитр. Растворы холестерина в стеклянном флаконе объемом 20 миллилитров испаряют органические растворители с помощью медленно протекающего аргона или газообразного азота до тех пор, пока на дне флакона не будет наблюдаться тонкая пленка липидов, поместите незакрытый стеклянный флакон в вакуумную сушку не менее чем на 30 минут.

Чтобы удалить остатки растворителя, перенесите два миллилитра буфера, предварительно пропущенного через фильтр 0,2 микрона, в стеклянный флакон для гидратации липидов. Инкубируйте смесь при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи и используйте в течение 48 часов для липосом размером от 30 до 100 нанометров. Освободите липосомальную суспензию в жидком азоте на 15 секунд.

Затем разморозьте липосомальную суспензию с помощью нагревательного блока при 42 градусах SIU в течение примерно трех минут. Повторяйте процесс замораживания и размораживания в общей сложности пять циклов. Замораживание и последующее размораживание получают Ella Les из многослойных везикул и повышают эффективность захвата липидов во время экструзии.

Затем подготовьтесь к экструзии, следуя инструкциям Avastin, чтобы аккуратно собрать липо так быстро. Правильная сборка экструдера LF 50 имеет решающее значение для предотвращения утечки азота, которая влияет на желаемую скорость потока. Чтобы обеспечить успех, тщательно выполняйте следующие действия.

Для изготовления герметичного уплотнения. Поместите опорную сетку с большим отверстием в основание опорного фильтра, а затем круглую центральную чашку, один дренажный диск и одну поликарбонатную мембрану. Поместите маленькое черное уплотнительное кольцо поверх мембраны и закрепите его на основании опорного фильтра.

Прикрепите верхний фильтрующий экструдер, закрутив четыре винта в четырех соответствующих отверстиях. Соберите блок экструдера с фильтром под большим цилиндром экструдера. Добавьте раствор липосомы в цилиндрический цилиндр в верхней части экструзионного цилиндра.

Установите большое круглое уплотнительное кольцо, узкую крышку, большое круглое уплотнительное кольцо и круглую крышку. Прикрепите газовый регулятор к верхней части цилиндра экструдера и закройте все клапаны, чтобы предотвратить утечку воздуха, включая клапан сброса давления. Поместите стеклянный флакон объемом 20 миллилитров или колбу Эрленмейера объемом 50 миллилитров под блок фильтрации экструдера.

Предохранительный клапан подсоединен к регулятору и разблокируется, если давление превышает 600 PS. Включаю газообразный азот и открываю газовый клапан, подключенный к экструдеру. Увеличьте давление азота до 25 фунтов на квадратный дюйм для липосом длиной 400 нанометров, до 125 фунтов на квадратный дюйм для липосом длиной 100 нанометров и до 400–500 фунтов на квадратный дюйм для липосом, размер которого составляет 30 нанометров. Наблюдайте за липосомной суспензией до тех пор, пока она не вытолкнется в контейнер под воздействием азота.

Поддерживайте подачу азота до тех пор, пока жидкость не исчезнет. Прохождение через фильтр экструдера в стеклянный напильник для выполнения DLS-анализа. Сначала приготовьте 50 микролитров 20 микромольного раствора липосом, разведенных в фосфатно-солевом буфере или PBS.

Затем включите источник питания и источник лампы. Перейдите к открытию программного обеспечения dynapro. Настройте программное обеспечение на модель алгоритма для обнаружения липосом нужного размера.

После подключения к аппаратной пипетке 14 микролитров образца липосомы в кварцевую диафрагму и вставить в держатель клетки, нажать кнопку «Старт» примерно после 20-30 сборов, нажать стоп. Проанализируйте средние пики диаметра липосом, зафиксированные на гистограмме. Анализ с отслеживанием наночастиц начинается с приготовления раствора липосомы объемом 500 мкл 0,1 микромоля, растворенного в PBS, промывания отсека для образца водой и этанолом.

Затем высушите отсек для образцов безворсовым бумажным полотенцем. Включите источник питания лазера, и компьютер подаст 300 микролитров 0,1 молярного раствора липосомы в отсек для образца. Откройте программное обеспечение для контроля температуры и анализа отслеживания наночастиц.

Нажмите кнопку захвата, чтобы включить лазер. Используйте горизонтальную и вертикальную регулировку для перемещения предметного столика и регулировки фокуса микроскопа. Установите желаемую температуру и время записи.

Нажмите кнопку записи, чтобы сделать несколько снимков липосомных частиц в течение определенного периода времени. Анализируйте пики, соответствующие диаметру липосом, размерам на гистограмме, поскольку она отслеживает движение каждой частицы. DLS — это установленный метод, который собирает рассеянный свет для определения диаметра частиц и был выполнен для определения размеров липосом.

Гидратированные липосомы экструдировали через поликарбонатные мембраны различных размеров и давлений, как описано в письменном протоколе. Диаметры липосом, измеренные с помощью DLS для размера пор 30 нм, составили 66 плюс-минус 28 нм. Для 100 нанометров размер пор составлял 138 плюс-минус 80 нанометров, а для 400 нанометров размер пор составлял 360 плюс-минус 25 нанометров.

В качестве калибровочного стандарта использовалась суспензия из 50-нанометровых полированных бусин Irene, где был зафиксирован диаметр 47 плюс-минус 16 нанометров. Процентная полидисперсия показывает, что в размерах липосома нет перекрытия. При использовании DLS-анализа обычно наблюдаются диаметры более 30 нанометров из-за известного смещения этого инструмента в сторону более крупных частиц.

Несмотря на это инструментальное ограничение, калибровочная кривая описывает алинеарную корреляцию. Анализ с отслеживанием наночастиц — это новая технология, которая измеряет размер каждой частицы на основе прямых наблюдений за диффузией в жидкой среде независимо от показателя преломления или плотности частиц. Этот метод с высоким разрешением может быть использован в дополнение к измерению липосом с DLS, NTA зафиксировал диаметры 95 плюс-минус 48 нанометров и 356 плюс-минус 51 нанометр для двух растворов полистирола 100 и 400 нанометров.

Липидные растворы имеют более сопоставимый диаметр по сравнению с DLS, образуя средние размеры 29 плюс-минус 14 нанометров для размера пор 30 нанометров, 95 плюс-минус 17 нанометров для размера пор 100 нанометров и 359 плюс-минус 73 нанометров для размера пор 400 нанометров. NTA может быть более общим методом определения характеристик для количественного определения микроскопических частиц, поскольку его чувствительность позволяет измерять частицы размером от 50 до 1000 нанометров. Калибровочная кривая показывает линейную корреляцию между паузой поликарбонатной мембраны и зарегистрированным диаметром NTA отрицательным пропусканием окрашивания Изображения электронной микроскопии показывают, что каждый размер липосомы после экструзии размером 3, 100 и 400 нанометров четко отличается друг от друга.

Увеличение было установлено в 25 000 раз с масштабной линейкой, представляющей 0,5 микрона. Был проведен эксперимент с тремя размерами липосом. DLS измеряли для каждого раствора липосомы сразу после экструзии.

Все растворы липосом хранились при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи. Их диаметры были повторно зарегистрированы DLS после ночной инкубации. После 60-часового инкубационного периода практически не наблюдалось никаких изменений При попытке выполнения этой процедуры важно помнить, что многократное прохождение через экструзионный фильтр улучшит однородность раствора Vesco.

Кроме того, не забывайте использовать стеклянные флаконы и шприцы для подготовки образцов, чтобы предотвратить загрязнение через выщелачивание полипропиленовыми пробирками хлороформа.