Изготовление и использование микроокружения микрочипов (MEArrays)

Общая цель следующего эксперимента заключается в измерении влияния различных микроокружений на клеточные функции адгезивных типов клеток путем их параллельного воздействия разнообразного набора микроокружений Combinator. Это достигается путем предварительного изготовления печатных подложек для обеспечения абсорбции смесей белков микроокружения. Затем подготавливаются мастер-пластины с белками микроокружения, которые используются для печати массивов ME с помощью робота для печати микромассивов с использованием перьевых или капиллярных игл.

Далее подготавливают основные планшеты с белками микроокружения. Затем адгезивные клетки культивируют на массиве ME с возможностью ограничения их количества. Полученные результаты, основанные на иммунофлуоресцентном анализе, демонстрируют влияние различных микроокружений на такие клеточные функции, как дифференцировка или пролиферация.

Идея этого метода возникла у нас, когда мы захотели количественно оценить влияние микроокружения тканей на принятие решений о судьбе стволовых клеток памяти человека, но поняли, что работа in vivo невозможна. Теперь, когда метод разработан, он находит множество применений в клеточной биологии, исследованиях и разработке лекарственных средств. PDMS используется в качестве субстрата, имитирующего более жесткие ткани, так как он недорог, прост в подготовке и удобен для печати.

Однако гидрофобность PDMS может привести к несовместимости с некоторыми клеточными линиями при использовании изделий из PDMS. Следует использовать перчатки без латекса, так как латекс может ингибировать полимеризацию PDMS. Для начала в одноразовом пластиковом стаканчике смешайте основу силиконового эластомера Sylgard 184 с отвердителем в соотношении 10:1 и тщательно перемешайте смесь деревянным или пластиковым шпателем.

Затем удалите пузырьки воздуха из смеси в вакуумном колоколе при комнатной температуре в течение 30 минут. Теперь поместите стандартное предметное стекло по центру привода вакуумного зажима центрифуги для нанесения покрытий, нанесите 0,5 milliliters смешанного эластомерного полимера на центр поверхности стекла и проведите центрифужное нанесение при 6 000 RPM в течение 60 секунд. Отверждайте стекла, покрытые PDMS, при 70 °C от четырех часов до ночи.

Слайды можно хранить в герметичной упаковке при комнатной температуре в течение нескольких месяцев. PA представляет собой гидрогель, который может имитировать мягкие ткани в диапазоне, в котором клетки PA будут прикрепляться только к участкам, содержащим белки, поддерживающие адгезию клеток. Начните с травления слайдов гидроксидом натрия.

Поместите предметные стекла на нагревательный блок при температуре 80 °C. Нанесите по 1 мл 0,1 н. гидроксида натрия на каждое стекло. Убедитесь, что вся поверхность стекла покрыта реагентом, иначе ПА не сработает.

Дайте гидроксиду натрия испариться, чтобы осталась белая пленка. Повторите этот процесс, если поверхность покрыта не полностью. При необходимости предметное стекло можно хранить при комнатной температуре в течение нескольких дней.

Затем нанесите покрытие из PES на предметные стекла в вытяжном шкафу. Поместите стекла в чашку объемом 15 milliliter. Добавьте 300 microliters PES на каждое предметное стекло, подвергнутое травлению гидроксидом натрия.

Оставьте APES взаимодействовать с гидроксидом натрия на предметных стеклах ровно на пять минут. Не дольше. Тщательно промойте APES деионизированной водой два-три раза с обеих сторон стекол.

В противном случае произойдет окисление с образованием коричневого осадка на предметных стеклах на следующем этапе. Теперь аспирируйте все растворы с поверхностей стекол в соответствующие кюветы. Добавьте 25 миллилитров 0,5% глутаральдегида в PBS.

Поместите предметные стекла в темное место и выждите 30 минут. По истечении 30 минут удалите весь раствор глутаральдегида с поверхности стекла с помощью аспиратора. Затем аккуратно просушите стекла, используя абсорбирующую безворсовую бумагу.

При необходимости предметные стекла теперь можно хранить при комнатной температуре в течение ночи. После приготовления и дегазации смесей ПА поместите их на лед, чтобы замедлить их полимеризацию. Непосредственно перед нанесением каждой смеси на предметные стекла, находящиеся на льду, добавьте персульфат аммония и TEMED, затем перемешайте их с помощью пипетки в течение 5–10 секунд.

Теперь нанесите смесь PA пипеткой на поверхности предметного стекла. Количество PA варьируется в зависимости от требуемой жесткости геля. Затем поместите покровные стекла поверх PA, не оказывая давления, чтобы избежать образования пузырьков.

Дайте ПА-гелю полимеризоваться в течение двух часов, после чего снимите покровные стекла под струей деионизированной воды. Промойте предметные стекла с ПА-гелем водой в больших стаканах Коплана в течение ночи. Чтобы удалить невступившие в реакцию акриламиды, на следующий день высушите стекла до полного затвердевания ПА-геля.

Затем предметные стекла можно хранить при температуре 4 °C в течение одного месяца в герметичном контейнере для стекол. Для начала установите пластиковую камеру так, чтобы она охватывала напечатанный массив на двухкамерном предметном стекле. Снимите камеры и разрежьте их пополам лезвием бритвы.

С помощью наконечника дозатора объемом 1 мл нанесите тонкую полоску аквариумного силикона на край камеры и прижмите ее к поверхности массива Emmy. Следите за тем, чтобы силикон не попал на структурные элементы массива. Обеспечение надежного прикрепления культуральных камер к массиву Emmy имеет решающее значение, так как неплотное прилегание камер приводит к утечке среды из них, что может вызвать массовую гибель клеток.

Для предметных стекол с покрытием из PDMS выполните блокировку, инкубируя их в 1% водном растворе Pluronic F 108 в течение 15 минут под вакуумом для любого из типов геля, затем трижды промойте массивы питательной средью для культур клеток с антибиотиками по пять минут за одну промывку. Это удаляет не вступившие в реакцию мономеры, которые в случае ПА-гелей могут быть токсичны для клеток. После третьей промывки оставьте образцы в среде для инкубации еще на 30 минут для регидратации геля.

Теперь поместите от четырех до пяти матриц в стерильную чашку Петри диаметром 15 сантиметров. В чашку добавьте половину конечного объема среды с интересующими клетками в концентрации, необходимой для их применения. Матрицы ME следует поместить в инкубатор, подходящий для поддержания жизнеспособности используемого типа клеток.

Каждые 15–20 минут во время наблюдения проверяйте под микроскопом равномерность прикрепления клеток к напечатанным структурам. Осторожно встряхните массивы ME, чтобы отличить прикрепившиеся клетки от плавающих. Время прикрепления может варьироваться, но обычно оно завершается в течение двух часов на массиве ME с кодированием PA.

После достижения насыщения прикрепления или истечения лимита времени аспирируйте неприкрепившиеся клетки и долейте среду в чашку до конечного объема на массивах ME с PDMS-покрытием. Полное удаление среды приведет к гибели клеток. Поэтому при каждой замене среды на данных предметных стеклах последовательно заменяйте половину объема среды, а затем долейте в чашку до конечного объема.

Культивирование может продолжаться в течение многих дней при условии регулярной замены среды. Распространенные фиксаторы, такие как параформальдегид, альдегид и смесь метанола с ацетоном, совместимы с системами массивов Emmy. Не забывайте, что даже при окрашивании массивы ME с PDMS-покрытием должны оставаться влажными.

Продолжите выполнение техники замены половины объема для подготовки предметных стекол с окрашенными микромассивами ME. С помощью лезвия бритвы удалите камеры и закрепите покровные стекла с использованием flora. Белок G был нанесен на напечатанный PDMS-кодированный микромассив ME с использованием кремниевых штифтов с квадратным наконечником на перьевом штифте.

Осаждение различных белков с помощью робота для печати микромассивов было подтверждено методом иммунофлуоресценции с использованием антител. Разведения растворов белков в мастер-планшете отражали количество вещества, осажденного на поверхность подложки для печати; клетки прикреплялись к напечатанным элементам в отчетливо выраженном соответствии с заданным рисунком. Аналогично, такой же отчетливый паттерн прикрепления клеток наблюдается при печати массива Emmy в масштабе 40 000 проходов.

Два белка микроокружения, закрепленные на ПАА-геле, вызывали концентрационно-зависимые профили экспрессии кератина в линии мультипотентных прогениторных клеток эпителия молочной железы человека. Логарифмическое отношение сигналов кератина 8 к сигналам кератина 14 иллюстрирует вариабельность и воспроизводимость сигнала. После 24 часов культивирования несвязанные клетки отмывают. В анализе было использовано 12 МЕ-массивов.

Для определения того, вызывают ли различные разведения коллагена I типа и рекомбинантного p-кадгерина человека изменения в экспрессии кератина, использовался стандартный статистический анализ. Первоначально, сразу после прикрепления клеток к поверхностям, отклонений от среднего значения не наблюдалось. Однако через 24 часа высокие концентрации коллагена I типа приводили к значительно более высокой экспрессии кератина 8.

В то время как высокие концентрации PCA в данной работе вызвали сильный сигнал кератина 14. Этот результат согласуется с предыдущими сообщениями о бипотентных клетках-предшественниках памяти. Ввиду динамического и взаимного характера взаимодействий между этими клетками и их микроокружением, сами клетки могут изменять состав напечатанных микроокружений.

Следовательно, чтобы понять острое воздействие созданных вами микроокружений, время экспозиции после данной процедуры не должно превышать 48 часов. Любой биологический процесс, который можно измерить с помощью флуоресцентного или другого анализа, может быть оценен в зависимости от микроокружения для поиска ответов на дополнительные вопросы, например: как различные микроокружения изменяют ответ на лекарственные препараты в линиях раковых клеток? Это можно определить по изменениям в апоптозе и пролиферации.

Или как микроокружение влияет на дифференцировку клеток-предшественников.