Изготовление и использование микроокружения микрочипов (MEArrays)

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы измерить влияние различных микроокружений на клеточные функции адгезивных типов клеток путем параллельного воздействия на разнообразную коллекцию микроокружений комбинатора. Это достигается за счет предварительного изготовления печатных материалов для поддержки поглощения смесей белков микросреды. Затем подготавливаются мастер-пластины белков микроокружения, которые используются для печати массивов МЭ с помощью печатного робота с помощью перьевого или капиллярного микрочипового робота.

Затем подготавливаются мастер-пластины с микроэкологическими белками. Затем адгезивные клетки культивируются на МЭ-матрице с возможностью ограничения количества клеток. Полученные результаты показывают влияние различных микроокружений на клеточные функции, такие как дифференцировка или пролиферация, на основе иммунофлуоресцентного анализа.

Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы хотели количественно оценить влияние микроокружения тканей на решения о судьбе стволовых клеток человеческой памяти, но мы поняли, что работать in vivo невозможно. Теперь, когда он разработан, он имеет множество применений в клеточной биологии, исследованиях и разработке лекарств. PDMS используется в качестве подложки, которая имитирует более жесткие ткани, поскольку она недорога, проста в приготовлении и печати.

Однако гидрофобность PDMS может сделать его несовместимым с некоторыми клеточными линиями при работе с PDMS. Перчатки без латекса, так как латекс может препятствовать полимеризации PDMS. Для начала в одноразовом пластиковом стаканчике смешайте основу из силиконового эластомера сигары 184 с отвердителем в соотношении 10 к одному и энергично перемешайте его с деревянным или пластиковым депрессором для языка.

Далее дегазируйте смесь в вакуумном колпаке комнатной температуры в течение 30 минут. Теперь центрируйте стандартное предметное стекло микроскопа на приводимом в действие вакуумном патроне спинового коера, затем сбрызните 0,5 миллилитра смешанного полимера эластомера на центр поверхности предметного стекла и вращайте слой со скоростью 6000 об/мин в течение 60 секунд. Отверждайте предметные стекла с покрытием PDMS при температуре 70 градусов Цельсия от четырех часов до ночи.

Предметные стекла могут храниться в герметичном виде при комнатной температуре в течение нескольких месяцев. PA — это гидрогель, который может имитировать более мягкие ткани в диапазоне, в котором клетки PA прикрепляются только к местам, где есть белки, поддерживающие клеточную адгезию. Начните с травления слайдов гидроксидом натрия.

Поместите горки на нагревательный блок при температуре 80 градусов Цельсия. Капните по одному миллилитру 0,1 нормального гидроксида натрия на каждое предметное стекло. Убедитесь, что вы закрыли всю поверхность предметного стекла, иначе усилитель воздуха выйдет из строя.

Дайте гидроксиду натрия испариться, оставив белую пленку. Повторите этот процесс, если поверхность покрыта не до конца. При необходимости предметное стекло можно хранить при комнатной температуре в течение нескольких дней.

Затем покройте слайды с помощью PES в вытяжном шкафу. Поместите горки в посуду объемом 15 миллилитров. Добавьте 300 микролитров PES на каждое травленое стекло с гидроксидом натрия.

Дайте A PES вступить в реакцию с предметными стеклами с гидроксидом натрия ровно пять минут. Не дольше. Тщательно промойте A PES деионизированной водой два-три раза с обеих сторон предметных стекол.

В противном случае он окислится, образуя коричневый налет на предметных стеклах на следующем этапе. Теперь отсасывайте все растворы с поверхностей горки к каждой тарелке. Добавьте 25 миллилитров 0,5% глутарового альдегида в PBS.

Поместите горки в темноту и подождите 30 минут. Через 30 минут отсасывайте весь раствор глутаральдегида с поверхности предметного стекла. Затем тщательно высушите слайды с помощью впитывающей безворсовой бумаги.

При необходимости предметные стекла теперь можно хранить при комнатной температуре в течение ночи. После приготовления и дегазации смесей PA поместите их на лед, чтобы замедлить их полимеризацию. Непосредственно перед приготовлением предметных стекол к каждой смеси на льду добавьте сульфат аммония и темид и тритруйте их с помощью пипетки в течение пяти-10 секунд.

Теперь нанесите смесь ПА пипеткой на поверхности предметного стекла. Количество PA варьируется в зависимости от требуемой твердости геля. Затем поместите стеклянную крышку на верхнюю часть PA, не оказывая давления, чтобы избежать образования пузырьков.

Дайте ПА-гелю полимеризоваться в течение двух часов, а затем снимите покровные стекла под деионизированной водой. Промойте гелевые стекла PA с водой в больших баночках Coplan на ночь. Чтобы удалить нереактивные акриламиды на следующий день, высушите предметные стекла до полного затвердевания PA-геля.

Затем предметные стекла можно хранить при температуре четыре градуса Цельсия в течение одного месяца в герметичной коробке для предметных стекол. Для начала устанавливается пластиковая камера, которая окружает напечатанный массив из двухкамерного предметного стекла. Снимите камеры и разрежьте их пополам лезвием бритвы.

С помощью кончика пипетки объемом в один миллилитр нанесите тонкую бусину аквариумного силикона на край камеры и прижмите ее к поверхности массива Эмми. Избегайте прикосновения силикона к какой-либо части массива. Обеспечение хорошего прикрепления культурных китов к массиву «Эмми» имеет решающее значение, потому что перии при прикреплении китов позволяют среде просачиваться из камер, что может привести к широкомасштабной гибели клеток.

Для предметных стекол с покрытием PDMS заблокируйте их, инкубировав их в водной среде 1%-ного F 108 в течение 15 минут под вакуумом для любого типа геля, промойте матрицы питательными средами для клеточных культур с антибиотиками три раза в течение пяти минут за промывку. Это удаляет нереактивные мономеры, которые могут быть токсичными для клеток в случае гелей PA. После третьего мытья дайте еще 30 минут инкубации в среде для регидратации геля.

Теперь поместите четыре-пять массивов в 15-сантиметровую стерильную чашку Петри. В чашку добавьте половину конечного объема среды с интересующими ячейками в необходимой для их применения концентрации. МЭ-матрицы должны быть помещены в инкубатор, подходящий для обслуживания используемого типа клеток.

Проверяйте равномерное прикрепление клеток к напечатанным элементам под микроскопом каждые 15-20 минут во время наблюдения. Осторожно встряхните массивы ME, чтобы различить прикрепленные и плавающие ячейки. Время подключения может варьироваться, но обычно оно завершается в течение двух часов на массиве ME с кодированием PA.

После насыщения присоединения или достижения предельного времени аспирируйте несвязанные клетки и заполните чашку до конечного объема на массивах ME с покрытием PDMS. Удаление всех сред убьет клетки. Так что для всех смена медиа на этих слайдах последовательно заменяют половину объема медиа и затем заполняют чашку конечным объемом.

Культивирование может продолжаться в течение многих дней при нормальной смене среды. Распространенные фиксаторы, такие как параформа, альдегид и метанол ацетон, совместимы с матричными системами Эмми. Не стоит забывать, что даже при окрашивании с покрытием PDMS, массивы ME должны оставаться влажными.

Поэтому продолжайте использовать технику замены половинного объема для подготовки слайдов окрашенных массивов ME. С помощью бритвенного лезвия снимите камеры и закрепите крышки с помощью флоры. Белок Mount G наносили на напечатанный массив ME с кодировкой PDMS с помощью силиконовых штифтов с квадратным наконечником на гусином штифте.

Осаждение различных белков с помощью микрочипового печатного робота было верифицировано методом иммунофлуоресценции с использованием антител. Разведения белковых растворов в мастер-пластине отражали количество, которое было нанесено на печатные субстраты поверхностных клеток, прикрепленных к напечатанным элементам очевидным узорчатым образом. Точно так же очевидная схема прикрепления клеток происходит, когда массив Эмми печатается по шкале 40 000 проходов.

ПА-гель с двумя белками микроокружения вызывал зависящие от концентрации профили экспрессии кератина в клеточной линии мультипотентного эпителия молочной железы человека. Логарифмическое отношение сигналов кератина 8 к сигналам кератина 14 иллюстрирует вариацию и воспроизводимость сигнала. После 24 часов культивирования несвязанные клетки смываются при анализе массивов из 12 me.

Стандартный статистический анализ был использован для определения того, приводят ли различные разведения коллагена первого типа и рекомбинантного человеческого p-кадгерина к изменениям экспрессии кератина. Первоначально не было никаких отклонений от среднего значения между клетками на признаках сразу после прикрепления. Тем не менее, через 24 часа высокие концентрации коллагена первого типа вызвали значительно более высокую экспрессию кератина 8-го типа.

В то время как высокие концентрации PCA в данном случае вызывают сильный сигнал кератина 14. Этот вывод согласуется с предыдущими отчетами о би-мощных клетках-предшественниках памяти. Из-за динамического и реципрокного характера этих взаимодействий с микроокружением клетки, эти клетки сами могут изменять состав напечатанных микроокружений.

Поэтому, чтобы понять острое воздействие микроокружений, которые вы печатаете, время воздействия не должно превышать 48 часов после этой процедуры. Любой теоретический процесс, который может быть измерен флуоресцентно или хально, может быть полезен как функция микроокружения для ответа на дополнительные вопросы, такие как: как различные микроокружения изменяют реакцию лекарств в раковых линиях? Он в основном связан с изменениями в птозе и пролиферации.

Или как микроокружение изменяет дифференцировку предшественников.