Трехмерные модели культуры клеток для измерения действию тканевой жидкости потока на опухолевой инвазии сотовых

Цель этой процедуры состоит в том, чтобы подвергнуть клетки, культивируемые в 3D, воздействию потока интерстициальной жидкости и количественно оценить опосредованное потоком влияние на клеточную инвазию. Это достигается путем предварительного приготовления гелевого раствора, состоящего из коллагена первого типа и матригеля. Второй шаг заключается в добавлении в раствор геля указанной концентрации клеток.

Затем клеточную суспензию добавляют до 12 миллиметров в диаметре, размера пор восемь микрон и инкубируют при 37 градусах Цельсия до тех пор, пока матрикс не станет гелеобразным. Заключительным этапом настройки анализа является добавление определенного количества среды в пробирные скважины для создания статических условий и условий потока. Через 24 часа трансвелловые мембраны фиксируются, окрашиваются и визуализируются для количественной оценки количества инвазированных клеток.

Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как микрофлюидные интерстициальные проточные камеры, заключается в том, что он не требует насосов или специализированного оборудования и позволяет исследователям легко и быстро тестировать несколько состояний или методов лечения. Хотя этот метод может дать представление о клеточной миграции и инвазии, он также может быть использован или применен для изучения влияния потока интерстициальной жидкости на другие важные клеточные функции, такие как экспрессия белка, пролиферация клеток и изменения в клеточной сигнализации. Демонстрацией этой процедуры будет LIMA two chaa.

Аспирант в моей лаборатории начал эту процедуру с того, что бросил небольшую аликвоту геля матри на лед при температуре четыре градуса Цельсия. Затем приготовьте рецепт геля со стерильной водой PBS, гидроксидом натрия, матригелем и коллагеном первого типа крысиного хвоста. Затем смешайте компоненты геля на льду в той же последовательности и выдержите окончательный раствор в течение одного часа при четырех градусах Цельсия.

Теперь поместите вставки для культуры восьми микроклеток диаметром 12 миллиметров в 12-луночный планшет с помощью пары стерилизованных щипцов. Затем подсчитайте клетки и ресуспендируйте их в сыворотке свободной среды из расчета пять умножить на 10 к шести клеткам на миллилитр, добавьте 100 микролитров клеточной суспензии на 900 микролитров гелевого раствора. После этого тщательно перемешайте их, аккуратно пипетируя вверх и вниз.

Впоследствии добавьте по 150 микролитров готовой смеси в каждую вставку. Затем перенесите вкладыши в инкубатор с 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия на 30 минут, пока гель не полимеризуется. Для статического состояния добавьте 100 микролитров сыворотки поверх геля и 1 200 микролитров микролитров под вкладыш.

Уровни жидкости внутри и снаружи вкладыша в лунке должны быть примерно одинаковыми, что приводит к минимальной разнице давлений на геле и отсутствию межтканевого потока. Для улучшения состояния текучести добавьте 100 микролитров сыворотки без среды под вкладыш и 650 микролитров над гелем. В то же время старайтесь избегать образования пузырьков воздуха под вставкой, так как они будут препятствовать миграции клеток через мембрану в этих местах.

Затем поместите тарелку в инкубатор с 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия на 24 часа. На этом этапе добавьте 500 микролитров однократного PBS на лунку в новую 24-луночную пластину для промывки вкладышей. Затем удалите оставшуюся среду в верхней части трендовых скважин потока.

Далее с помощью ватных палочек удалите гель со вставок. Протрите верхнюю часть поверхности мембраны, чтобы удалить клетки, не относящиеся к VA. Затем промойте вкладыши, поместив их в 24-луночную пластину, содержащую один PBS, на 15 секунд.

После этого удалите PBS и добавьте 500 микролитров 4% параформальдегида под каждую вставку. Инкубируйте их в течение 30 минут при комнатной температуре для фиксации трансмигрировавших клеток. Затем удалите PFA и промойте их один раз 500 микролитрами PBS, чтобы удалить остаточный фиксатор.

Далее добавьте под вкладыши 500 микролитров 0,5%-ного раствора Triton X 100 и выдерживайте 10 минут при комнатной температуре. Чтобы проникнуть в клетки, вырежьте мембраны из вставки с помощью лезвия бритвы. Затем поместите их в 100 микролитров двух микрограммов на миллилитр DPI в одном растворе PBS.

Будьте осторожны, расположите нижнюю сторону мембраны лицевой стороной вниз. Раствор DPI необходимо приготовить за несколько минут до использования и хранить в темноте. Теперь оберните тарелку алюминиевой фольгой.

Поместите его на шейкер при 150 об/мин на 30 минут комнатной температуры. Затем промойте мембраны в 500 микролитрах один раз PBS и поместите их обратно в шейкер на 10 минут. Чтобы удалить свободный jy, повторите промывку еще два раза.

Следующим шагом является размещение мембран на предметных стеклах трансмигрировавшими клетками вверх. Добавьте монтажный раствор к мембранам. Затем накройте их покровными листами.

После этого подсчитайте пятнистое пятно по ядрам и подсчитайте количество инвазированных клеток в соответствии с прилагаемой рукописью. На этом рисунке показаны трансмигрировавшие клетки MDA MB 4 35 s на мембране. Инвазированные клетки фиксировали после анализа инвазии интерстициального потока жидкости и окрашивали DPI и конъюгированным foid Alexa Fluor 4 88 для облегчения подсчета инвазированных клеток.

Это мембрана под светлым полем, а вот пятнистые ядра. Здесь показан фоид Alexa Fluor 4 88, окрашенный F-актином. Этот график показывает, что инвазия клеток метастатической меланомы MDA MB 4 35 s была значительно усилена интерстициальным потоком.

Через 24 часа результаты нормализуются до среднего значения статической инвазии и представляется среднее значение по шести вставкам клеточных культур. Разница между условиями статистически значима при значении P 0,003. После освоения анализ потока интерстициальной жидкости может быть настроен через два часа, за которым следует 24-часовая инкубация, а затем два часа для фиксации и окрашивания трансформационных мембран.

После этой процедуры клетки, белки или нуклеиновые кислоты могут быть легко экстрагированы, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как изменение экспрессии генов и белков в ответ на поток интерстициальной жидкости. С момента своего развития он стал важным анализом для исследователей, изучающих влияние интерстициального потока на раковые клетки.